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文獻解讀

集思慧遠客戶發表《褪黑素對水稻白葉枯病菌生長的抑制作用》

FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:640



  水稻白葉枯病(Xoo)引起水稻細菌性疫病(BB),是世界各地水稻生長最廣泛、危害最嚴重的病害之一。褪黑素通過誘導植物天然免疫增強病原菌抗性,但褪黑素對植物致病菌的直接作用尚不清楚。本論文研究了褪黑素對Xoo的直接作用,結果表明外源性褪黑素200μg/mL可明顯抑制Xoo的增殖,降低5個細胞分裂相關基因的mRNA表達。這種濃度的褪黑素也抑制了Xoo的運動和生物膜的形成。值得注意的是,褪黑素可以改變Xoo細胞的長度。為了更深入地了解這種抗菌作用的機制,本研究采用RNA-Seq檢測了200μg/mL褪黑素對Xoo菌株PXO99全局基因表達的影響。褪黑素處理后,Xoo細胞中與催化活性和金屬結合活性相關的差異表達基因(DEGS)被下調。此外,對碳水化合物和氨基酸代謝的DEGs也受到下調。這些結果提示褪黑素抑制Xoo增殖的機制可能涉及調節細胞分裂,同時降低參與新陳代謝的酶的濃度或活性。


  材料與方法

  細菌菌株與植物

  采用剪葉法對水稻葉片接種Xoo菌株PXO99進行致病性試驗。用無針注射器法對煙葉接種PXO99進行過敏反應(HR)監測。


  褪黑素對細菌生長影響的測定

  對不同濃度(0、200、400或1000μg/mL)褪黑素及無褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶劑處理的細菌菌株每3h測定一次OD600,直至細菌生長達到靜止階段。每個實驗進行三次,每個實驗重復三次。


  透射電鏡觀察

  對不同濃度(0、200或400μg/mL)褪黑素及無褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶劑處理的細菌標本做陰性染色,然后用相機拍攝。


  細胞運動和生物膜形成的測定

  對不同濃度(0、10、40或250μg/mL)褪黑素及無褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶劑處理的Xoo菌株PXO99進行細胞運動和生物膜測定,每個實驗進行三次,每次實驗分別重復五次和六次。


  內源性褪黑素的測定

  利用LC-MS對不同濃度褪黑素(0或200μg/mL)處理的Xoo菌株PXO99進行內源性褪黑素含量的檢測。


  RNA測序與數據分析

  不同處理:MOH(M0)和200μg/mL褪黑素(M200)

  檢測平臺:Illumina HiSeq Xten

  差異基因篩選條件:log2FC>2,p<0.01

  實時熒光定量

  采用qRT-PCR技術對選取的18個基因進行了驗證分析。


  結果與討論


  1.褪黑素抑制Xoo生長

  圖1褪黑素抑制Xoo的生長

  注:(A)在褪黑素處理下,PXO99的狀況。(B)對不同濃度褪黑素(μg/mL)處理后培養24h的PXO99生長曲線進行統計分析。

  甲醇(模擬對照)和不同濃度褪黑素處理的Xoo細菌生長速率(圖1A)。褪黑素(200μg/mL)預處理24h后,PXO99的OD600值約為1.0,僅為對照組的一半(圖1B)。因此,200μg/mL的褪黑素能有效地抑制PXO99的生長。當濃度升高時,細菌密度顯示出更大的降低。褪黑激素在一定濃度下抑制人類致病細菌的生長,包括在2μg/mL的無乳鏈球菌和1000μg/mL的釀酒酵母中。生長抑制結果表明,褪黑素以濃度依賴性的方式抑制PXO99的生長,其抑制作用可能是劑量依賴性的。

  

  2.褪黑素減少Xoo泳動能力但增加生物膜形成


  圖2褪黑素處理對Xoo泳動力(A)和生物膜形成(B)影響的統計分析


  為研究褪黑素對細菌運動的影響,測定了褪黑素存在和不存在時Xoo的游動直徑。由于觀察到較高濃度的褪黑素破壞了Xoo的泳動能力。因此,在隨后的試驗中,褪黑素的用量不超過200μg/mL。如圖2A所示,10μg/mL褪黑素平板的菌落直徑比模擬對照減少了30%以上。隨著褪黑素濃度的增加,泳動直徑進一步減小。200μg/mLL褪黑素平板的菌落直徑比模擬對照減少一半以上。因此,褪黑素以濃度依賴性的方式影響Xoo的運動。這些結果顯示褪黑素對細菌運動的抑制作用可能是通過增加細胞死亡來實現的,盡管有必要對此進行進一步的研究。


  為評價褪黑素對Xoo附著的影響,分析了PXO99在褪黑素挑戰下的生物膜形成情況。如圖2B所示,10μg/mL褪黑素的存在稍微增加了PXO99的生物膜形成。當褪黑素濃度增加時,OD595處的CV吸光度增加幅度較大。觀察到的含有40μg/mL褪黑激素的管的OD595值比模擬對照高三倍。然而,當褪黑素存在于高濃度時,則觀察到相反的效果。在含褪黑素200μg/mL的試管中,OD595值比對照組低40%。因此,褪黑素對PXO99生物膜形成的影響與觀察到的對游動或生長抑制的影響不相似。當褪黑素濃度較高時,無游動或生物膜形成。結果表明,低濃度褪黑素可誘導Xoo形成生物膜,高濃度時則抑制其形成。


  

  3.Xoo因褪黑素而高度富集

  圖3 Xoo中褪黑素的提取與鑒定

  注:(A)與褪黑素相對應的色譜圖。(a)與未使用褪黑激素(Sigma)處理的PxO99細胞收集的褪黑素相對應的色譜圖。(b)用褪黑素(Sigma)預處理PXO99細胞收集的褪黑素相對應的色譜圖。(B)PXO99細胞褪黑素(ng/cells)的統計分析。紫外響應:280nm。


  利用LC-MS測定了褪黑素對PXO99細胞內源性褪黑素含量的影響。30mL培養液培養24h后,POX99細胞內源性褪黑素為14.43ng。與外源性褪黑素共同孵育的POX99細胞培養24h后,從30mL培養液中分離得到內源性褪黑素156.13ng(圖3A)。結果表明,褪黑素可以很容易地穿過細胞壁,并在Xoo細胞中富集。處理組內源性褪黑素約為對照組的100倍(圖3B)。這種破壞正常內源性褪黑素水平的Xoo可能會抑制這種細菌的增殖。


  4.褪黑素抑制Xoo細胞分裂

  圖4褪黑素作用下Xoo細胞分裂相關基因mRNA表達的qRT-PCR分析


  為探討褪黑素是否通過干擾或抑制細胞分裂而抑制細菌增殖,用qRT-PCR方法檢測了褪黑素(200μg/mL)對PXO99細胞分裂相關基因的mRNA表達。如圖4所示,與對照組相比,褪黑素處理的Xoo細胞中有4個細胞分裂相關基因(FetQ、ZapE、FetL和FetE)被上調,5種基因(ZipA、FetB、ZapA、FetD和FetZ)表達下調。結果表明,褪黑素處理導致Xoo細胞分裂減少。因為細菌的增殖取決于細胞的分裂能力,在細胞分裂過程中,Xoo的生長受到抑制。


  5.褪黑素改變Xoo形態


  圖5褪黑素處理后Xoo形態的觀察

  注:(A)PXO99細胞的形態:(A)不經褪黑素處理的PXO99細胞的形態;(B)褪黑素處理的PXO99細胞的形態(200μg/mL)。(B)對PXO99細胞寬度和長度的統計分析。Bar=0.5m。


  本研究通過透射電鏡觀察褪黑素對PXO99細胞形態的影響。如圖5所示,使用負染色法通過TEM容易地區分細菌大小和形狀。單個PXO99細胞的寬度和長度分別為0.6至1.0μm和1.0至2.7μm(圖5A)。相比之下,褪黑素處理的PXO99細胞的寬度略短于對照組,200μg/mL的褪黑素處理的PXO99細胞的長度與對照相比明顯減少(20%)(圖5B)。這些數據表明褪黑素處理后PXO99細胞長度的減少可能是由于抑制Xoo增殖所致。


  6.褪黑素處理Xoo的RNA-Seq轉錄體分析


  為進一步探討褪黑素對Xoo增殖的影響機制,收集了褪黑素處理或未處理的PXO99細胞的總RNA,并進行了RNA-Seq分析。通過對RNA-seq檢測得到的基因表達變化的分析表明,138個基因在處理后21h對褪黑素的刺激下,mRNA轉錄水平發生了改變(表1),相當于Xoo基因組的2.73%。共有14個上調基因,124個下調基因,并且這些DEGs通過GO數據庫來表征,GO數據庫提供關于細胞組分,分子功能和生物過程的注釋信息,并通過KEGG數據庫注釋。其中,在14個上調基因中,4個在鞭毛成分中富集,4個在轉運活性上富集,3個參與代謝過程。


  圖6基因本體論(GO)富集和細胞圖譜對差異表達基因的分類


  圖7通過qRT-PCR在mRNA水平上對18個差異表達基因的驗證


  在觀察到的下調基因中,與細胞膜和細胞成分相關的基因在細胞成分類別中有明顯的過度表達(圖6A)。此外,編碼催化活性相關蛋白的基因在分子功能類別中被過度表達(圖6B)。一致地,觀察到與生物過程類別中的代謝過程相關的基因的顯著過度表達(圖6C)。在代謝過程中,有41個基因在生物過程中占主導地位(圖6C)。催化活性和金屬結合活性分別有56個和27個基因在分子功能類別中占主導地位(圖6B)。為驗證轉錄產物的可靠性,采用qRT-PCR技術對隨機選取的18個基因進行了分析,結果與測序數據一致(圖7)。在褪黑素處理的PXO99中,與氧化磷酸化、檸檬酸循環、蛋白質分泌和雙組分系統相關的基因被下調。


  7.褪黑素調節Xoo代謝

  圖8褪黑素處理下PXO99代謝差異基因的分類


  代謝是細菌的一個重要特征,據報道褪黑素能顯著降低微生物代謝相關基因的mRNA表達。在這項研究中,我們觀察到參與碳水化合物和氨基酸代謝的基因是豐富的(圖8)。Xoo生長的最佳碳源和氮源是蔗糖和谷氨酸。有趣的是,參與異生物代謝的18個基因被下調(圖8)。褪黑素具有很強的結合銅和鐵(III)的能力。因此,我們推測褪黑素可以導致細菌細胞游離鐵缺乏,并通過抑制褪黑素的金屬結合活性或通過降低金屬結合酶的濃度和活性來抑制生長。此外,位于細胞膜上與磷酸轉運蛋白和參與能量代謝的磷酸鹽結合蛋白相關的DEGs編碼蛋白均被下調(圖8)。


  結論

  本研究探討了褪黑素對稻瘟病菌(X.oryzae,PV.Oryzae)的潛在作用。我們的數據顯示褪黑素可以穿過細胞壁,在Xoo細胞中富集,抑制這種細菌的細胞分裂和增殖。重要的是,褪黑素改變了細胞結構,降低了Xoo細胞的泳動能力和附著能力。轉錄組分析結果提示褪黑素對Xoo增殖的抑制作用可能是通過(1)減少細胞分裂,(2)降低代謝相關酶的濃度和活性來實現的。本工作為進一步了解褪黑素對細菌生長和基因表達的抑制作用提供了新的思路。