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文獻解讀

集思慧遠客戶發表《水稻對基腐病響應的長鏈非編碼RNA的全基因組鑒定和鑒定》

FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:474

  1.植物長非編碼RNA(IncRNA)是一種新興的表觀遺傳調控因子,在植物生長發育和生物脅迫反應中發揮著重要作用。然而,lncrna是否參與了水稻與Dickeya zeae之間的抗性反應尚不清楚,Dickeya zeae是一種引起水稻基腐病的細菌性病害。在本研究中,rna-seq被用來揭示由D.zeae反應性LncRNAs及其候選靶基因介導的共表達調控網絡。在鑒定的4709個LncRNAs中,對D.zeae感染分別有2518個上調和2191個下調LncRNAs。采用qPCR方法研究了17個lncRNA及其在防御反應中潛在作用的預測靶點的表達變化。在D.zeae感染時,5個INcRNAs的表達水平上調,而同源候選靶基因的表達水平下降。此外,此外,一些lncrna被預測為osas - mir396和osas - mir156的靶基因模擬物。這些結果表明,IncRNAs可能通過調節水稻靶基因和miRNAs的轉錄水平,對D.zeae感染起反應作用。

  

  2.病原體接種

  材料:4個品種:Nanjing 40,Nanjing 45,Kasalath,Nipponbare

  采用莖基接種法和根接種法測定水稻植株對水稻基腐病病菌D.zeae的抗性。通過測定接種后10天內患病面積的百分比,將耐藥率分為5組。莖、根部無明顯疾病癥狀,表明免疫。疾病指數小于或等于5,表明抗病性很強。疾病指數從5.1到12.4表示中度抗藥性。從12.5到19.9的疾病指數表示中度易感性。表示高度易感性的疾病指數等于或大于20。

  測序平臺:Illumina Hiseq 2500,PE=100 bp

  分析軟件:TopHat2;Cufflinks;Cuffcompare;與miRBase排除miRNA前體;CPC;Hmmer;Pfam;t test;DEGseq;HemI,Cytoscape軟件

  實驗驗證:qRT-PCR

  

  3.結果分析

  1.耐藥粳稻對D.zeae的應答

  在抗性水稻品種南京40中觀察到超敏反應抑制了D. zeae的感染和侵襲,而3個易感水稻品種南京45、Kasalath和Nipponbare在10 dpi位點附近出現典型的病徵(圖2A)。從根系接種實驗來看,南京40號比南京45號更耐D. zeae,表現為枯葉、黑腐病癥狀和惡臭(圖2B)。

  Fig 2 抗性和易感表型對基腐病菌感染的反應。(A)和(B)分別以基莖接種法和根接種法觀察到的表型

  兩次接種試驗結果表明,南京40對D.zeae具有較高的抗性,因此選擇南京40為材料進行高通量測序,分析了LncRNA介導的抗性機制。


  2. 水稻與基腐病不親和相互作用中RNA-seq的研究進展

  分析RNA-seq數據,共鑒定出南京40中4841個LncRNA,其中,在感染樣本(K2)和對照(K1)中分別鑒定到3221個和2713個LncRNA(圖3A)。檢測到的LncRNAs長度在200~1500 bp之間,200~300 bp的LncRNAs占60.8%(圖3B)。這些LncRNA平均分布在12條水稻染色體上(圖3C)。根據它們在基因組中的位置,分別有1581個、2138個和1122個被認為是內含子LncRNA、LincRNAs(稱為長基因間非編碼RNA或基因間lncRNAs)和反義lncRNAs。在圖3中,它們在12條染色體上的分布是由從外到內的不同同心圓環所顯示的(圖3D)。

  Fig.3 LncRNA鑒定結果。(A)檢測到的INcRNAs和mRNAs的數量。(B)LncRNA的長度分布。(C)兩個文庫中INcRNA的基因組分布。外同心圓環代表來自K1的IncRNAs,內同心圓環代表來自K2的lncRNAs。(D)三種LncRNAs的分布。內含子INcRNAs(外橙色圓)的數量,在每個染色體的500 kb(千堿基)的bin中,lincRNAs(內綠圈)和反義lncRNAs(內藍圈)。內含子INcRNA是由蛋白質編碼基因的內含子區域產生的。lincRNAs(長基因間非編碼RNA)是從水稻基因組的基因間區域轉錄而來的。反義incRNAs是從反義鏈轉錄而來,部分重疊于一個或多個蛋白編碼基因的外顯子。


  3. 鑒定D.zeae應答型LncRNAs

  與K2相比,K1樣品根中共鑒定出4709個LncRNAs (p值< 0.05),包括2518個上調lncRNAs和2191個下調lncRNAs(圖4A)。其中,2123個LncRNA是僅在接種D.zeae后的南京40中檢測到,1597個LncRNA是在對照(K1)中檢測到,989個LncRNA在2組樣品中均檢測出(圖4B)。圖4C中的熱圖顯示在K1和K2有33個lncRNA差異表達(圖4C)。差異表達的lncRNA表明這些lncRNA在感染D.zeae的一定時間點后開始起作用。


  Fig.4鑒定lncRNAs對抗性水稻品種中的D. zeae有響應。(A)接種D.zeae后,抗性水稻品種中差異表達INcRNAs的數量。(B) lncrna對耐藥水稻D. zeae特異性應答。K2和K1是只有在有接種和不接種的抗性水稻品種中才能檢測到的INcRNAs數量。K1+K2,兩個文庫中檢測到的INcRNA數目。(C)采用層次聚類的方法在兩個文庫中差異表達INcRNA。


  4. 防御途徑中LncRNAs與靶基因的共表達分析

  為了識別lncRNA潛在的mRNA靶點,分析了差異表達lncRNA在100kb兩側區域內的差異表達情況。RNA-seq的轉錄組數據確定了與防御反應相關的多個信號通路中最重要的10個上調靶點,如植物過氧化物酶、Rab GTPase家族2 (Rab2)、替代氧化酶、MATE家族蛋白、MYB家族轉錄因子、K+鉀轉運體、黃酮類還原酶、谷胱甘肽s -轉移酶等(表1)。前10個下調靶點包括過氧化物酶47、過氧化物酶A2、兩個E3泛素-蛋白連接酶、兩個DUFs(表1)。大多數靶點,包括過氧化物酶和E3泛素-蛋白連接酶都參與了防御反應信號通路。LncRNA及其mRNA共表達分析發現,除了OS08G0113000、OS05G0110000和OS02G0101700外,有17個LncRNA調控了20個靶點中的17個靶點表達(表1)。


  表1 在RNA-seq的基礎上,對D. zeae反應前10個上調和下調靶點


  此外,通過Cytoscape軟件構建了17個lncRNA-靶點的交互網絡。其中有7個具有多于4個節點的網絡,剩下的10個具有少于3個節點的網絡(圖5)。圖5A所示的交互網絡包含8個靶基因,包括MYB轉錄因子、鋅指和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,這些基因在抗性水稻品種中被3個lncRNA (TCONS_00055600、TCONS_00055598和TCONS_00055597)調控,以響應D. zeae的感染。圖5B所示的交互網絡代表三個lncRNA(TCONS_00012775、TCONS_00012782和TCONS_00012789)調控6個靶點,包括小亞基過程體的基因編碼成分、未知功能域(DUFs)蛋白和WRKY轉錄因子。TCONS_00080557和TCONS_00080558的靶點為含鈣結合基序蛋白、磷酸-3-硫葉酸合成酶、50年代核糖體蛋白L24和過氧化物酶(圖5C)。此外,在6個INcRNAs和4個目標之間發現了一個更為復雜的交互網絡(圖5D)。這4個靶點由無特征蛋白(OS02G0317800)、替代氧化酶(OS02G0318100)、具有7個富含亮氨酸重復序列(LRR;OS02G0317500)的f -box樣蛋白(clathrin adaptor)和OS02G0317400組成,這些蛋白可能對水稻中的D. zeae有應答作用。


  Fig.5 四對lncRNAs -靶點的預測交互網絡。(A)-(D)顯示不同INcRNA-靶點的相互作用網絡。三角形節點和矩形節點分別表示lncRNA和相關靶點。紅色和綠色分別代表上調和下調的節點。線條顯示了INcRNAs-靶點對之間的相互作用。實線和虛線分別表示已驗證的和未驗證的IncRNA-靶點對,分別見表1。

  參與這些網絡的靶點包括植物過氧化物酶、交替氧化酶、過氧化物酶、轉錄因子、E3泛素-蛋白連接酶等。這些INcRNAs-靶點對可能在防御D.zeae感染方面起著調節作用。


  5. 在不相容的相互作用中lncRNA-miRNA網絡的串擾

  在此之前,兩個miRNAs,osa-mir 396和osa-mir 156分別被證明參與了水稻的防御反應。利用lncRNA測序數據預測了lncRNA作為miR396和miR156潛在的ceRNAs模擬物,并分析了它們的表達變化(表2)。TCONS_00042166、TCONS_00064123和TCONS_00081640三種LncRNA被預測為OSA-miR 396的ceRNAs模擬(表2)。6個lncRNA,TCONS_00012844、TCONS_00043299、TCONS_00102384、TCONS_00102574、TCONS_00072934和TCONS_00013133被預測為osai - mir156的ceRNAs(表2)。值得注意的是,一些mRNA基因可能是miRNA osamiR156和osa-miR396的靶標,預測為泛素蛋白連接酶,液泡分選受體蛋白,酯酶蛋白和參與防御反應的轉錄因子(表2)表明lncRNA可以在不相容的相互作用中調節miRNA抵抗D.zeae。


  表2 抗性水稻中lncRNA作為ceRNAs對D. zeae應答反應的表達譜


  6. D.zeae響應型IncRNAs的驗證

  隨機選取17個差異表達的LncRNAs進行qPCR分析。在17種lncRNA中,13種顯著上調,4種顯著下調(表3)。

  表3 根據歸一化數據和隨機選取的rna-seq數據,隨機選擇了17個差異表達的lncRNAs

  qPCR分析結果證實了17個lncRNAs的表達變化,盡管三個lncRNAs(TCONS_00064963,TCONS_00044026和TCONS_00012775)顯示相反的結果(圖6)。


  Fig.6 用qPCR方法驗證了RNA-seq中的INcRNA。(A)和(B)分別用qPCR驗證了10個上調的和7個下調的lncRNAs的表達水平。

  隨機選取10個靶點(5個上調基因和5個下調基因對D. zeae應答反應),通過qPCR檢測其差異表達模式(圖7)。盡管RNAseq(圖7A)和qPCR(圖7B和C)的變化程度不同,但這10個基因的表達模式是一致的。


  Fig.7 用qPCR方法檢測10個靶標的表達水平。(A)在不相容的相互作用中,根據歸一化讀碼數,有10個顯著差異表達的目標基因。(B)和(C)用qPCR分析5個上調和下調靶點的表達水平。a表明K1與K2之間有顯著性差異(P<0.05)。


  4.總結

  在這項研究中,使用RNA-seq鑒定和表征抗性水稻品種中針對D. zeae感染的lncRNAs。共檢測到4709個IncRNAs,2518個上調,2191個下調。用qPCR方法檢測了所篩選的lncRNAs及其靶基因的RNA-seq表達水平。部分INcRNAs被預測為miRNAs的靶基因。本研究的結果為進一步了解lncRNA在水稻細菌性基腐病抗性調控中的作用提供了依據,也為今后通過產生lncRNA轉基因植株來培育耐基腐病的水稻提供了潛在的途徑。


  參考文獻:

  http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2018/ra/c8ra04993a