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文獻解讀

集思慧遠客戶發表《檀香激素誘導和不同組織中新的RT-qPCR參考基因的篩選與驗證 》

FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:593

  YINGWENBIAOTI:Selection and Validation of Novel RT-qPCR Reference Genes under Hormonal Stimuli and in Diferent Tissues of Santalum album

幸运飞艇官方开户   ZAZHI:Scientific  Reports

  YINGXIANGYINZI:IF=4.122



  逆轉錄實時定量聚合酶鏈式反應 (RT-qPCR)因其高通量、特異性和敏感性而被廣泛應用于基因表達水平的研究。為了獲得準確可靠的結果,RT-qPCR分析必須有一個合適的參考基因。到目前為止,經濟熱帶樹種檀香((Santalum album L.)還沒有被驗證的可靠參考基因。在本研究中,有13個候選參考基因(包括從大量的檀香轉錄組數據中篩選出的12個新的可能的參考基因,以及目前使用的β-actin基因)在不同的組織(莖、葉、根和愈傷組織)、以及水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、赤霉素(GA)處理作用下的愈傷組織中,用GeNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT和 RefFinder算法綜合驗證。幾種新的候選參考基因比目前使用的傳統基因ACT要穩定得多。SA處理中ODD和Fbp1、MeJA處理中的CSA 和Fbp3、JA處理中的PP2C和Fbp2、以及3個激素處理中FBP 1和FBP 2,分別是最準確的參考基因。當FAB1A與PP2C結合后,被鑒定為四種組織最適宜的參考基因組合。而HLMt, PPR和FAB1A的組合則是所有實驗樣本中最理想的參考基因。此外,為了驗證我們的結果,我們還通過參考基因及他們的組合在MeJA處理下的三種檀香組織中評估了SaSSy基因的相對表達水平。本研究中所鑒定的參考基因將提高RT-qPCR分析的準確性,并將有助于不同組織和激素處理下的檀香功能基因組學研究。


  材料和方法

  植物材料:收集三株5-7年的檀香根、莖、葉。

  用新芽誘導生成愈傷組織,并用SA、MeJA和GA處理。

  利用RNA-seq數據篩選候選參考基因及引物設計qPCR和擴增效率


  基因穩定性分析:五個不同的程序:geNorm(版本3.5),NormFinder ,BestKeeper ,Delta CT 和RefFind ,被用來確定候選參考基因的穩定度

  參考基因的驗證

  為了驗證RefFinder工具推薦的參考基因(包括最不穩定和最穩定的參考基因及其組合)的可靠性。合成α-,β-和epi-β-三烯的關鍵基因(檀香油(Z)-α-santalol和(Z)-β-santalol主要成分的前體)SaSSy的表達量被檢測驗證。分別在檀香的根、莖、葉及不同時間處理下MeJA處理的愈傷組織中用 2-ΔΔCq方法檢測。


  結果

  基于轉錄組數據的候選參考基因的選擇

  基于此前發布的RNAseq表達數據,篩選出變異系數(CV)在9.75%~11.95%之間的12個基因。表1列出了候選參考基因名稱、GeneBank登錄號、引物序列、TM值、擴增長度、擴增效率、R2值和KS-測試p值。

  表1. 選擇候選參考基因、引物、TM和KS-測試p值和擴增特征

  圖1.  13個候選參考基因的Cq值在所有實驗樣本中的分布。

  候選參考基因在不同組織中的表達穩定性及在激素處理下檀香的表達穩定性


  表2. geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT和RefFinder計算的13個候選參考基因的表達穩定性

  圖2.應用geNorm軟件對13個參考基因的配對變異(V)分析。用geNorm法計算不同組織和激素處理樣品中配對變化Vn/Vn+ 1


  此外,我們還根據RefFinder推薦的綜合排名,驗證了候選參考基因在特定組織和不同組織組合中的穩定性(圖3)。


  圖3 RefFinder推薦的13個參考基因在特定組織和不同組織組合中的綜合表達穩定性


  不同組織和MEJA處理下所鑒定的參考基因的驗證

  為了驗證所鑒定的參考基因,用參考基因中對一個關鍵基因

  Sassy的表達進行了研究,并在三種組織和MEJA處理下進行了鑒定。

  圖4. 經驗證的參考基因在檀香不同組織A)MEJA處理中B)的相對表達水平


  總結

  在本研究中,13個候選參考基因,包括從3個不同組織(莖、葉和根)的大量RNA-seq數據中篩選出的12個新基因,以及目前傳統管家基因ACT, 用RT-qPCR進行評定。

  五種統計算法 (geNorm, NormFinder, BestKeeper, Delta Ct and RefFinder)對這些參考基因的表達穩定性進行了評價。

  還研究了合成檀香油主要成分的關鍵基因SaSSy ,驗證了新鑒定的穩定參考基因的適用性。

  這一工作驗證了一組更穩定的新的參考基因,并將促進、擴大和加強不同組織和激素處理下檀香中基因表達的分析。