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文獻解讀

集思慧遠客戶發表《綠色草莓個體重測序揭示全基因組范圍內變異及自交不親和候選基因分析》

幸运飞艇官方开户FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:651

  摘要

  草莓屬配子體不親和系統的研究已經廣為人知了,但是其遺傳機制目前仍是未知的。通過人工自花授粉獲得了11個不同親和性的第二世代綠色草莓,用來代表不同的坐果率水平。本研究對兩個較大差異坐果率的自交系進行全基因組重測序,Ls-S2-53(自交不親和)和Ls-S2-76(強自交親和)。利用完全自交親和的野草莓作為參考樣品,進行兩個綠色草莓全基因組變異檢測和注釋分析。兩測序樣品間每條染色體上的多態分布都很相似,但是純合變異的數量和分布區域是不一致的。基因表達分析表明6個和自交不親和顯著相關的候選基因,用野草莓基因組作為參考,將一個FIP2-like(肌動蛋白骨架合成相關)作為兩個自交不親和自交系的候選基因,該基因編碼的肽鏈在兩個材料中均存在不同長短的數量的氨基酸數量的丟失。通過抑制FIP2-like的表達減少了花粉管頂端F-actin的合成,在一定程度上抑制了花粉粒的生成和花粉管的發育。研究結果表明差異的純合變異分布影響了綠色草莓的果實坐果率,完整編碼的FIP2-like能夠正常促進F-actin的合成,而較短氨基酸序列的FIP2-like對兩個自花授粉草莓的親和性有影響。


  材料方法

  植物材料:F.viridis 42,Ls-S1-2,11個Ls-S1-2自交系;測序材料:Ls-S2-53,Ls-S2-76(幼嫩葉片);Ls-S2-53人工自花授粉后(0h)葉、花梗、花萼、花瓣、雌蕊、花藥用來做組織特異表達分析,雌蕊自花授粉后(6,12,24,48,72h)做時空表達分析。

  測序策略:Illumina Hiseq 2500,Ls-S2-53(80X),Ls-S2-76(75X)。

  參考基因組:F. vesca reference genome v2.0.a1;

  比對參考基因組:BWA v0.6.1,過濾冗余序列:SAMtools,變異檢測:GATK

  變異位點注釋:SnpEff,基因功能注釋:NR,Swiss-Prot,GO,COG,KEGG。

  配子體自交不親和候選基因挑選:研究報道,除了S-locus基因外,一些發生修飾改變的基因也參與花粉管發育(生理生化代謝,信號轉導,),挑選的候選基因基于基因功能注釋及序列突變分析(非同義突變,終止密碼子獲得或丟失,移碼突變,編碼缺失等),共挑選17個基因進行組織特異表達分析。

  F-actin體外可視化:Zeiss LSM 800 confocal laser scanning microscope;

  FIP2-like亞細胞定位:完全可育材料F.vesca 41花藥cDNA全長,載體pDONR221,特異引物:FIP2-like-Sub。農桿菌介導,本氏煙葉片


  研究結果

  1、果實性狀及花粉管特征



  F.vesca 41坐果率100%,綠色草莓品種,F1,其他11個F2坐果率(2%-80%),花柱中花粉管穿過的比例(人工授粉后12h出現)。


  2、基因組重測序及比對分析

  Ls-S2-53,Ls-S2-76測序數據分別clean base 19G,17.6G,覆蓋90%基因組



  全基因組范圍內兩個親和性不同的株系變異信息(內-外:SV,INDEL,SNP)

  純合突變區域在全基因組的分布情況(SNP,indel區間雜合度<10%),橫坐標代表每條染色體物理位置,縱坐標(左)標記數量,(右)染色體;純合區域:紅框。


  3、變異位點功能注釋

  基因間區變異信息遠超過CDS區,CDS區內部內含子突變高于外顯子。SNP分布比例由高到低:基因間區,外顯子,CDS,內含子;INDEL分布比例由高到低:基因間區,內含子,CDS,外顯子。


  部分Pfam數據庫注釋到的非同義(橙色),同義突變基因(粉色)。


  根據功能注釋和基因發生的變異信息挑選的146個可能與自交不親和相關的基因在基因組上的分布。


  4、隨機挑選候選基因RT-PCR驗證

  自交不親和品系17個基因的人工自花授粉后(0,12,24,48,72h)雌蕊中的時空表達分析(左),葉、花梗、花萼、花瓣、雌蕊、花藥組織特異性表達分析(右);大多數基因主要是在雌蕊或花藥中高表達,進而對候選基因FIP2-like,在強自交親和性材料和完全自交親和材料中進行表達模式分析,發現自交親和與強自交親和材料表現相似,但與完全親和材料不同。FIP2-like在花藥中隨著花藥的成熟,表達量也是逐漸上升的,并且在花粉中的表達量也高于花藥。


  5、自交不親和候選基因FIP2-like克隆

  a.P1:完全自交親和,P2:自交不親和,P3:強自交親和;b.1/2分別以DNA和cDNA為模板擴增完全親和全長FIP2-like,3/4不親和材料(該基因無內含子);c.結構域分析(P2,P3功能結構域截斷或缺失)


  6、FIP2-like瞬時表達

  a/c. Ls-S2-53, Ls-S2-76, F. vesca以及增加或抑制F-actin材料之間花粉粒發芽速率比較表明,隨著F-actin含量的上升,發芽速率逐漸上升,含量出現下降,發芽速率也隨之下降。b.花粉管綠色熒光表示F-actin含量,完全自交親和材料增加或者抑制F-actin,熒光強弱符合一致性。亞細胞定位結果表明:FIP2-like存在細胞膜和細胞核中。


  研究亮點

  針對兩個自交不親和草莓品系的重測序數據分析,利用生信分析的手段鑒定到一系列與自交不親和性相關的候選基因。

  1、挑選了17個候選基因進行組織特異性表達和時空特異表達檢測分析,大多數基因是在雌蕊或花藥中高表達,而針對其中感興趣的FIP2-like在花藥中的時空表達分析表明該基因隨著花藥的成熟,表達量逐漸上調。

  2、針對其中FIP2-like進行不同親和性材料中的克隆比較,發現自交不親和材料與完全親和材料間該基因編碼蛋白長度缺失了一段。

  3、亞細胞定位表明FIP2-like存在細胞膜和細胞核中,瞬時表達實驗結果支持該基因的表達豐度與花粉粒發芽存在正相關的關系。