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文獻解讀

韓國國產大豆代謝組學性狀的高度地理特異性

FABURIQI:2019-12-11 LIULANCISHU:84


摘要

在分子水平上對農產品進行分類和表征是重要的,但對基因分型通常是不可行的,特別是對于具有多種變種和地方品種的大豆。另外,代謝特征(營養價值的決定因素)可以是良好的分子指標,它反映了種植區域依賴的因素,例如氣候和土壤。

因此,我們分析了在7個不同省份(代表產區)種植的韓國大豆的綜合代謝譜,并探討了與地理特征的潛在關聯。使用氣相色譜飛行時間質譜(GC-TOFMS)和液相色譜Orbitrap質譜(LC-OrbitrapMS)對總共210種初級和次級代謝物進行了分析。盡管大豆品種存在部分異質性,但基于多元統計數據的代謝組學表型分析表明,大豆的化學成分特征主要受區域特異性的控制。OPLS-DA模型提出了由5種代謝物(色氨酸、丙二酰染料木苷、丙二酰大豆苷、N-乙酰鳥氨酸和烯賴氨酸)組成的生物標志物簇(AUCS=0.870~1.0)。最具特色的代謝圖譜是群山Gunsan(中西部海岸)和大邱Daegu(東南內陸地區)的大豆,它們分別以異黃酮和氨基酸含量最高為特征。對地理數據的進一步詢問表明,區域特定代謝特征與一般土壤結構和氣候特征(總降雨量和平均年溫度)之間存在關聯。

1引言

大豆是一種廣泛種植的農產品,其食用豆在許多亞洲國家被用作主食、蛋白質和脂質的主要來源。大豆還富含一系列次生代謝物,這些物質已被證明對心血管疾病具有藥理作用,例如:骨質疏松癥、乳腺癌和前列腺癌和老年癡呆癥。與其他農作物一樣,營養成分因多種匯合因素而異。例如,具有不同基因型的不同品種可能是導致特征基因表達和代謝活動的關鍵因素。此外,大豆可能會得益于候和土壤等外部因素,這些因素也可能對大豆的代謝特性產生重大影響。有關大豆品種的信息對于全面評估其組成特性至關重要,但是,要遵循譜系是非常困難的,尤其是在已經注冊了178個大豆品種的韓國。此外,據報道,大豆品種的市場壽命很短。例如,提交給大豆品種信息計劃(美國伊利諾伊州大豆協會支持的計劃)的品種中,有一半以上是新品種。當然,事實導致對大豆原產地確定的限制,最近韓國已將其添加到標簽強制性清單中。在這種情況下,根據地理區域分類對大豆進行代謝表征似乎是最合適的方法之一。中國大豆的代謝產物譜研究已有報道,但其代謝產物受揮發性物質或少量異黃酮和花青素的限制。最近的一項研究報告了基于核磁共振的代謝物譜,結合地理特征的綜合分析,但在韓國國內地區是在大豆葉片而不是大豆上。

因此,這項工作的主要目的是為表征韓國7個不同生長省份國內種植的大豆的代謝特性提供全面的信息和強大的平臺。通過將GC-TOFMSLC-Orbitrap MS與先進的統計方法結合使用,我們獲得了210種主要和次要代謝物圖譜,這些圖譜顯示了區域特異性和假定的地理特征。

2材料與方法

2.1材料

黃豆苷元,黃豆苷,染料木素,染料木苷,黃豆黃苷,黃豆黃素苷,槲皮素和大豆皂甙I購自Sigma-Aldrich作為標準正化合物。LC-MS級甲醇,2-丙醇,乙腈,水和甲酸購自ThermoFisher Scientific

2.2大豆樣品采集

2015年(5月至11月)種植的大豆樣本是從韓國7個省(代表性生產區)的當地農場收集的,這些農場存放在國家農產品質量管理局,目的是區分種植來源。該地區(單一品種或混合品種)包括Paju(Jangdanbaekmok100%)Inje(Danwon 70%Cheonga30%)Boeun(Danwon 100%)Gunsan(Danwon70%Seopung 30%)Gangjin(Taekwang100%)Daegu(Danwon 70%、野生型30%)Hamyang(Danwon40%Taewang 40%、野生型20%)(S1)

2.3大豆代謝物提取

每組3個生物學重復,冷凍干燥后研磨,置于-80℃保存。

2.4總黃酮含量及抗氧化活性測定

對原方法稍作修改,用比色法測定總黃酮含量,在510nm處測定反應物的吸光度。這些程序重復了三遍。槲皮素標準溶液(4050607080μg/mL)的校準曲線以槲皮素等量(QEs)確定,數據表示為每1克干重毫克QEmgQE /g)。

總抗氧化能力使用OxiTeC總抗氧化能力測定試劑盒(BiMax,韓國)制造商的協議。

2.5地理和氣候數據

月總降雨量(mm)和平均溫度(°C)的數據來自韓國氣象局(20155月至11月)[http://www.kma.go.kr/index.jsp](圖S2AC)。關于省級土壤質地的信息是從美國農業部(USDA)獲得的(圖S2E)。

2.6初級代謝物的GC-TOFMS分析

檢測平臺:Agilent7890B-Leco Pegasus HT;掃描范圍:85-500m/z

分析軟件:ChromaTOF software 4.50 version

2.7次級代謝物的LC-OrbitrapMS分析

檢測平臺:WatersAcquity UPLC-Q-Exactive Plus instrument (Thermo Fisher Scientifific, MA, USA);掃描范圍:100-1200Da

分析軟件:Xcalibur4.0Q-Exactive Tune software

2.8統計分析

SIMCA 14用于PCAOPLS-DAROC分析;基于超幾何學測試和相對中間性中心性進行通路過度表達分析,并使用MetaboAnalyst中實現的模塊進行模式搜索以確定特定區域的代謝產物。基于基于pearson相關和平均連鎖方法,使用MultiExperiment Viewer進行層次聚類分析和熱圖可視化。利用ChemRICH進行了化學富集計算和圖形可視化。簡單地說,該方法比較了由結構相似性和化學本體(中間主題詞數據庫)構建的化學簇的統計顯著性。用Kolmogorov-smirnov檢驗評價統計學意義。

3結果

3.1總黃酮含量和抗氧化活性根據栽培區的不同而不同

1A對總黃酮含量進行了分析和總結。各地區含量差異不顯著,在61.366.5mgQE/g之間,但群山Gunsan的含量略低(54.5mgQE/gp<0.03)。Trolox等效抗氧化能力測定為總抗氧化活性。在大邱Daegu種植的大豆(圖1B)的活性最高,其次是坡州Paju、麟蹄Inje和報恩Boeun地區。位于韓國南部的群山Gunsan和康津Gangjin的活動最低。


1 不同地區栽培大豆總黃酮含量(A)和抗氧化活性(B

注:不同字母(abc)顯示了不同區域間的顯著差異(p<0.05)。

3.2韓國7個不同地區栽培大豆的綜合代謝物判別模型

從在韓國7個不同地區栽培的大豆中獲得了初級和次級代謝物圖譜。GC-TOFMS分析得到900個代謝特征,其中92個化合物是基于Binbase算法進行結構鑒定的。利用UPLC-OrbitrapMS對次生代謝物進行了適應性分析。隨后的串聯質譜(MS/MS)鑒定出118種已知結構的化合物。初級和次級代謝物分為碳水化合物(11%)、氨基酸(23%)、脂肪酰(6%)、甘油磷脂(7%)、丙烯醇脂質(7%)、類黃酮(3%)、異黃酮(6%)和其他化合物。

首先根據無監督的多變量統計(PCA)檢查代謝組學表型。得分散點圖顯示了群山Gunsan,麟蹄Inje和大邱Daegu地區的輪廓的明顯區分,而其他地區則被分離(圖S3B)。類似地,HCA根據區域詳細說明了代謝物輪廓的相對距離(圖2A)。坡州Paju區和報恩Boeun區的大豆代謝產物表現出最密切的連鎖關系,其次是咸陽HamYang和康津Gangjin,以及麟蹄Inje和大邱Daegu地區之間的相似性。來自群山Gunsan的大豆顯示出最獨特的圖譜,與多變量統計分析一致。此外,載荷散點圖分析表明與每個區域高度相關的代謝產物(圖S4)。

隨后的OPLS-DA構建了具有良好適應度(R2Y=0.946)和可預測性(Q2=0.778)的監督模型。在該模型的基礎上,根據VIP評分對5種代謝物進行排序,并將其轉化為一個奇異向量,檢驗代謝物特征是否能區分所有7個區域的大豆。用ROC分析評價了該集作為生物標記簇的可預測性。AUC值在0.870~1.0(95%可信區間0.653~1.0)范圍內均顯著高于對照組(2C)。需要注意的是,與5種內源化合物重組的奇異值允許同時區分所有7種大豆的地理來源。代謝物清單包括色氨酸,這是次級代謝物生產的關鍵前體。其他的是丙二酰基異黃酮(丙二酰染料木苷和丙二酰大豆苷)和含氮化合物(N-乙酰鳥氨酸和醛賴氨酸)。與糖苷(大豆苷、黃豆黃苷和染料木素)相比,丙二酰基具有更高的不良口感。丙二酰基異黃酮是大豆食品中豐富的營養成分,具有潛在的藥用活性。關于這些化合物的詳細資料載于補充表1


2不同栽培區域特異性的綜合代謝表型

注:(A)對7個不同地區種植的210種代謝物進行了層次聚類分析。(B)采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)(R2Y=0.946Q2=0.778)繪制分數散點圖。(C)曲線下的面積(AUCs)和95%的置信區間,按ROC曲線分析,基于五種代謝物,按變量投影重要度(VIP)排序。

3.3大豆初級和次級代謝產物中反映的區域特異性獨特性和共性

應用Metaboanalyst分析中的模式搜索模塊,對栽培區特有的代謝產物進行了查詢。統計結果表明,代謝物與栽培區之間存在著獨特的相關性,與其他地區相比,這些代謝物可以轉化為相對豐度。載荷散點圖分析(圖S4)直觀地顯示,大邱Daegu種植的大豆與次級代謝物含量的正相關程度最高,而群山Gunsan種植的大豆與初級代謝物的相關程度最高(圖3AB)。代謝特征一般與總黃酮含量和抗氧化活性相對應(1)。此外,化學富集分析提供了基于化學相似性和本體映射的統計標準的綜合分類(圖3CD)。大豆異黃酮是大邱地區的次生代謝產物,與其他地區相比,大邱Daegu的次生代謝物含量最高,氨基酸含量顯著降低。與此形成鮮明對比的是,在群山Gunsan地區,含有仲胺和丁酸鹽的氨基酸特別豐富。


3栽培區特異性代謝物的鑒定

注:在Metaboanalyst中用模式搜索算法計算出與群山GunsanA)和大邱DaeguB)強相關的前25位代謝物列表。粉紅色和藍色分別表示正相關系數和負相關系數。群山GunsanC)和大邱DaeguD)中210種化合物的化學相似富集分析。X軸給出了代謝物簇的分配系數(XlogP)Y軸通過Kolmogorov-Smirnov檢驗表明了具有統計學意義的水平。每個簇中的節是根據增加或減少的化合物(紅色=增加,藍色=減少,粉紅色=混合)的比例來著色的。用ChemRICH進行了繪圖和計算。

3.3.1群山Gunsan地區

根據多元統計(PCAOPLS-DA,圖S2B2BHCA,圖2A)確定,群山Gunsan大豆在所有區域中顯示出最獨特的代謝特征。特別是,各種氨基酸含量的富集是該省的特征(谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸和脯氨酸)(圖3A)。值得注意的是,脯氨酸衍生物,水蘇堿的豐度是其他區域的18倍,具有較高的區域特異性(t=9.0)。糖醇和糖衍生物在該地區的含量較高(甘油酸、甘油、海藻糖、赤藻糖醇和賴西托)(3A)

3.3.2大邱Daegu地區

與其它區域相比,大邱Daegu區的大豆具有顯著更高的次級代謝產物(類黃酮和異黃酮類)的含量。黃酮類化合物分為黃酮苷(蘆丁和芹菜苷)和黃酮(山奈酚)。山奈酚,一種富含多種植物和植物源性食品的黃酮醇,在該地區的含量是其他地區的1.9倍。蘆丁(黃酮-3-O-)和芹菜素(黃酮-7-O-)含量分別是其他6個地區的1.9倍和4.4倍。大邱富含的異黃酮包括1個異黃酮和5個異黃酮O-糖苷。黃酮類化合物含量較高,抗氧化活性顯著提高(1)。其它特征化合物是磷脂、溶血卵磷脂和溶血磷脂的溶血形式(3B)

3.3.3麟蹄Inje地區

麟蹄Inje的大豆與大邱的大豆具有相對可比性,大邱與韓國東部省份具有相同的地理位置。HCA計算的熱圖確定了這兩個區域與其他區域不同的共生代謝產物。在這兩個地區,染料木素和大豆苷的乙酰形態都很豐富,而在大邱地區,則只有較高含量的染料木素和大豆苷元含量較高。同樣,溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺在這兩個地區都是共同豐富的(黃色框,圖2A)。在其他次級代謝物中,黃酮類、圣草酚和柚皮素含量較高,特別是在Inje地區(分別是其他區域的1.5倍和1.4)。大豆皂甙(βa)和糖醇(松糖醇、梨糖醇、肌醇和半乳糖醇)含量高,是麟蹄Inje地區大豆特有的。大豆皂甙γaInje區的特異性最強(t=6.4)

3.3.4報恩Boeun和坡州Paju地區

與其他6個地區相比,報恩Boeun大豆的初級代謝產物含量相對較低。在報恩Boeun區,甘油磷脂、飽和脂肪酸和碳水化合物的中間產物含量相對較低。它包括乙醇胺、膽堿、LysoPC181、棕櫚酸、七烷酸、硬脂酸、葡萄糖、果糖和木糖。相反,報恩Boeun地區5種化合物(L-精氨酸、精氨酸、腺苷3’-單磷酸、3-吲哚丙烯酸和焦磷酸)含量相對較高。Paju大豆的代謝譜與Boeun區的代謝譜相似程度最高(2AB)Paju大豆的代謝唯一性最好由生物標志物簇的成分AllysineN乙酰annithyt>4.0)中的富集含量決定。生物標志物簇合物烯丙基賴氨酸和N-乙酰鳥氨酸的含量(T>4.0)是測定坡州Paju大豆代謝唯一性的最佳指標。氨基酸(β-丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和高L-精氨酸)具有中等水平的正連鎖和區域特異性(t<4.0)。同樣地,在次級代謝物中,丙二酰甘氨酸、大豆皂甙αg和大豆皂甙Bd在坡州Paju區域表現出正相關性。

3.3.5康津Gangjin和咸陽Hamyang地區

大豆代謝物分布在康津Gangjin和漢陽Hamyang地區最具可比性(圖2AB),兩者都位于韓國南部省份。在康津Gangjin大豆中,共有32種化合物呈顯著正相關(p<.05),其中13種代謝產物含量較高(t>4.0)。在PLsTCA循環中間體(蘋果酸和富馬酸)和含N化合物(泛酸和哌啶酸)lyso形式中,區域特異性最高。這一地區醛類和二肽含量顯著高于其它地區,而槲皮素、圣草酚、丙二酰黃豆苷和丙二酰染料木苷含量相對較低。咸陽Hamyang大豆的性狀表現為正相關和負關聯的最低水平。前25種候選代謝物中只有7個化合物顯著相關。其中有3種代謝產物存在于相對較高的水平(眼酸、蜜二糖和胍丁胺)。

3.4.大豆代謝特異性可能相關地理性狀的探討

為了替代可能與獨特代謝產物圖譜相關的合理因素,我們分析了地理和氣候數據(20155月至11月)。數據包括緯度、經度、平均溫度和總雨量(圖S2AC)。其中,群山Gunsan和大邱Daegu地區的總降雨量與其他地區相比,特別是在8月,呈現出明顯的月降水模式(S2A)。大邱Daegu地區在栽培期間,特別是5月至7月的平均溫度最高,而群山Gunsan和康津Gangjin地區的平均溫度在8月至11月高于其他地區(圖S2C)。對土壤質地進行了進一步的研究,一般分為狹縫壤土、砂壤土和外來土。群山Gunsan地區土壤質地類型主要為粉砂壤土(S2E)。相反,大邱Daegu、麟蹄Inje和咸陽HamYang地區(東海岸)被劃分為砂壤土,而坡州Paju、報恩Boeun和康津Gangjin地區(西海岸)則具有借土特征。

4總結

本研究的主要目標是:1)建立大豆代謝產物的多重質譜分析方法,2)根據大豆的栽培區域特異性,為提出大豆代謝的唯一性提供概念證明,可用于農產品種植原產地的判別。本研究在GC-MSLC-MS的基礎上,獲得了實際種植在區域性商業農場的大豆樣品的綜合代謝譜,并由國家農產品質量管理局收集用于鑒別種植來源。綜上所述,多變量統計模型與相關模式搜索相結合,確定了栽培區特有的代謝特征。隨后對地理特征與區域特定代謝特征的結合進行了探討,提出了假設的關聯性,該關聯性可推廣應用于韓國農產品國內種植原產地的真實確定。