幸运飞艇官方开户

服務熱線:025-85381280
文獻解讀

集思慧遠客戶發表《Nrf2和自噬在調節A549細胞系中TLR4-NFκB介導的,由雞舍PM2.5引起的炎癥中的作用》

FABURIQI:2019-08-08 LIULANCISHU:367

IF: 5.108

摘要

       雞舍顆粒物(PM)對人和雞的呼吸健康有不利影響,進一步影響動物性能,降低生產效率。然而,對PM2.5引起的呼吸系統炎癥的研究很少,其機制也不清楚。本研究以人腺癌肺泡基底上皮細胞(A549細胞)為研究對象,對PM2.5引起的炎癥反應進行研究,探討Nrf2和自噬在炎癥調節中的作用。結果表明,經PM2.5處理后,A549細胞的活力呈時間和濃度依賴性下降。經PM2.5處理12h后的TNFα、IL6和IL8顯著增加。RNA測序表明,差異表達的基因在免疫系統過程、氧化應激(OS)、內質網應激(ERS)和自噬中豐富。進一步研究表明,TLR4-NFkB p65信號通路參與了PM2.5引起的炎癥反應。Nrf2的過度表達顯著降低了TNFα、IL6、IL8的水平以及NFkB p65和NFkB pp65的水平。在PM2.5處理的細胞中,Nrf2的過度活化也限制了OS和ERS。PM2.5誘導的自噬通過增加NFkB p65和NFkB pp65水平促進炎癥的發生。自噬缺陷增強了Nrf2的表達。總之,我們的研究顯示Nrf2可以防止由雞舍PM2.5刺激引起的炎癥,然而,自噬在TLR4-NFkB p65中起到促進作用,介導A549細胞的炎癥。

材料

       材料分為PM2.5采集和A549細胞系(人腺癌肺泡基底上皮細胞)兩個部分,這里著重講一下轉錄組測序的材料部分:用25μg/ml的PM2.5處理12小時,對A549細胞進行RNA-seq測序分析,測序平臺為illumina Hiseq平臺,采用PE150測序。

實驗結果

1. PM2.5降低細胞活性和誘導炎癥響應

       TNFα誘導上皮屏障功能喪失并增強單核細胞的通透性,作為促炎細胞因子促進IL1β、IL6和IL8的分泌,IL1β可激活巨噬細胞和中性粒細胞;IL6可激活中性粒細胞和B淋巴細胞的增殖;IL8是一種趨化因子,可激活中性粒細胞。

       PM2.5處理后的細胞上清液以112 g離心20分鐘,用于檢測種炎性細胞因子。采用酶聯免疫吸附測定試劑盒測定腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細胞介素1β(IL1β)、白細胞介素6(IL6)、白細胞介素8(IL8)的水平。

A:MTT法對細胞活性檢測

B:酶聯免疫吸附法對TNFα、IL1β、IL6和IL8檢測


       PM2.5對A549細胞施加了細胞毒性,誘導了TNFα、IL6和IL8的釋放,通過這些釋放,A549細胞的免疫增強,防御了PM2.5的刺激

2. 轉錄組分析結果

       用25μg/ml的PM2.5處理12小時,對A549細胞進行RNA-seq測序分析。最終得到557個差異基因,427個上調,130個下調。



A:GO富集圖,顯示抗氧化還原功能、免疫系統、刺激響應得到顯著富集

B:KEGG通路分類圖,差異基因在免疫疾病、傳染病、免疫系統過程中富集

C:OS、ERS、自噬相關基因熱圖,重點挑基因,例如和OS相關的LOX、ALOXE3、GPX7、PRDX2、GSTT2B,和ERS相關的ORM2。同時發現SPAAR上調了,而前人研究SPAAR可以負調控mTORC1(雷帕霉素點),促進自噬激活。

3. TLRs-NFκB信號通路調節A549在PM2.5作用下引起的炎癥

       Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。NFκB家族由p60、p52、rela(p65)、c-rel和relb組成。NF-κB是對有害細胞刺激的第一反應者。當細胞受到各種外界因素(包括應激損傷、脂多糖、病毒、氧自由基等)的刺激時,IκB被IκB激酶(IκK)磷酸化,然后將NFκB分離并轉移到核中,開始轉錄。p65有轉錄激活域調節基因表達陽性,所以接下來將NFκB p65作為對象研究。NFκB pp65是由處于活性狀態的NFκB p65的不同絲氨酸位點的磷酸化產生的。

       TLRs-NF-κB信號通路是細胞中廣泛存在的信號轉導途徑,在免疫、炎癥、腫瘤等眾多疾病的發生發展中起著重要作用。

A:TLRs相關基因RT-PCR表達驗證,用25 μg/ml的PM2.5處理12h

B:免疫熒光法檢測NFκB pp65的位置,用25 μg/ml的PM2.5處理12h

C:分別在0、3、6、12、24、48 h時,用PM2.5刺激后檢測NFκB p65和NFκB pp65


       PM2.5激活了TLRs信號通路,促進TLR、TICAM1、TRAM2的高表達,PM2.5刺激下,NFκB p65和NFκB pp65也被激活了。在PM2.5 處理后NFκB pp65的水平升高。在12h時,NFκB p65和NFκB pp65的水平達到最高,然后同時下降,呈現時間依賴性方式。表明,TLR4-NFκB p65信號在PM2.5處理后被激活,并引起TNFα、IL6和IL8的釋放。4. PM2.5對A549細胞中OS和ERS的影響氧化應激(OS)是由高活性分子(如活性氧化物質(ROS))與抗氧化系統在人體受到各種有害刺激時的清除率之間的不平衡造成的。內質網應激(ERS)是一種對氧化應激、缺血、營養不良、病毒感染引起的應激的保護性反應,其過程可以減少未折疊蛋白的異常積累,保持細胞的穩態。ERS是通過折疊蛋白和錯誤折疊蛋白的積累以及內質網中的鈣丟失或鈣超載來實現的。GRP78和活性轉錄因子6(ATF6)是ERS的關鍵調節因子,其功能涉及蛋白質的正確折疊和組裝。CHOP是ATF6的下游基因,涉及ERS引起的凋亡和炎癥。

       活性氧(ROS)檢測、鈣離子(Ca2+)檢測和RT-PCR及western blot。

A:共聚焦顯微鏡觀察PM2.5處理后的ROS含量增加

B:共聚焦顯微鏡觀察PM2.5處理后的Ca2+含量增加

C:和OS和ERS相關基因的RT-PCR表達驗證,大部分與RNA-seq一致

D:免疫印跡法檢測GRP78和CHOP在PM2.5處理后的表達

       PM2.5刺激增加了細胞內的的Ca2+,RT-PCR顯示ORM2和CHOP顯著升高,與RNA-seq結果一致。GRP78的表達呈上升趨勢,ATF6下降。PM2.5處理誘導的GRP78和CHOP在前12小時逐漸升高,在24小時和48小時下降。,CHOP的表達與PM2.5處理后12小時ATF6的表達不一致。盡管CHOP水平在12小時內逐漸升高,但在24小時和48小時下降,顯示時間依賴性方式。ATF6在12h表達呈下降趨勢,可能導致24h CHOP表達下降。

5. Nrf2在降低PM2.5引起的A549細胞炎癥中的作用

       Nrf2作為轉錄因子可在氧化應激(OS)中被激活。Nrf2調節下游抗氧化基因表達,在保護細胞免受親電細胞、氧化劑和異物的損害方面發揮著重要的作用。

       PM2.5處理后采用熒光免疫組化、western blot實驗檢測Nrf2的表達變化,過表達Nrf2實驗檢測炎癥因子的表達變化,基因沉默Nrf2檢測NFkB表達變化。


A:免疫熒光法檢測PM2.5處理后Nrf2的表達增加。

B:免疫印跡法檢測PM2.5處理后Nrf2的表達先升后降,時間依賴降低。

C:免疫印跡法檢測細胞質和細胞核在PM2.5和TBHQ(叔丁基對苯二酚,抗氧化)處理后Nrf2的表達

D:過表達Nrf2,檢測TNFα, IL6, IL8的含量增加

E:RNA干擾Nrf2后,檢測NFkB p65、NFkB pp65的變化

6. Nrf2在抑制PM2.5引起A549細胞中的OS和ERS

       熒光檢測ROS和Ca2+,基因沉默Nrf2后檢測CHOP和GRP78。


A:共聚焦顯微鏡觀察過活化Nrf2后細胞內ROS的含量增加

B:共聚焦顯微鏡觀察過活化Nrf2后細胞內Ca2+的含量增加

C:RNA干擾Nrf2后,檢測CHOP和GRP78含量的降低

7. PM2.5誘導細胞自噬

       自噬作為一個重要的病理和生理保守過程,可以將蛋白質、糖原、脂類、核苷酸、其他大分子和細胞器分離到自噬體中,并轉運到溶酶體中進行降解,以維持細胞的更新和穩態。SPAAR可以負調控mTORC1(雷帕霉素靶點),促進自噬激活。ATG(autophagy-related protein)就是和自噬相關的基因。LAMP2(lysosomal associated membrane protein)是溶酶體相關蛋白,LC(microtubule - associated protein light chain),也是一種自噬相關蛋白。BECN1也是一種公認的自噬相關蛋白。


A:自噬相關基因的RT-PCR表達驗證

B:免疫印跡法檢測BECN1、LC3II、ATG7和LAMP2在PM2.5處理后0、3、6、12、24、48小時的表達。

C:共聚焦顯微鏡下免疫熒光檢測LC3的點狀結構

D:透射電鏡檢測在PM2.5處理后0、3、6、12、24、48小時后自噬體的積累,箭頭為自噬體

8. 自噬缺陷對NFκB p65、NFκB pp65和Nrf2表達的影響

       本試驗采用ATG7-sirna處理細胞6小時,以阻斷ATG7的表達,然后去除培養基進行以下分析。

       ATG7缺陷下調了NFκB p65和NFκB pp65,表明由PM2.5引起的自噬促進了PM2.5介導的A549細胞的炎癥。此外,自噬缺陷對用PM2.5處理的sirna-ATG7的Nrf2表達有積極影響。

結論

       1、PM2.5降低了A549細胞的活性并誘導炎癥。

       2、TLR4-NFκB信號通路參與了A549細胞PM2.5誘導的炎癥反應。

       3、Nrf2通過抑制OS和ERS降低PM2.5誘導的炎癥。

       4、自噬通過增強NFκB p65和NFκB pp65的表達來促進PM2.5誘導的炎癥。