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文獻解讀

集思慧遠客戶發表《整合蛋白質組和轉錄組數據揭示了釀酒酵母對禾谷鐮刀菌的控制機制》

FABURIQI:2019-07-04 LIULANCISHU:361


合作單位:江蘇大學食品與生物工程學院

摘要

背景:據報道,拮抗微生物能有效地控制禾谷鐮刀菌的侵染。然而,有關釀酒酵母對禾谷鐮刀菌的控制作用的信息有限,同時通過蛋白質組學和轉錄技術研究其可能的調控機制。

結果:我們的研究結果如下所示,釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1的生長有明顯的抑制作用,釀酒酵母Y-912也顯著抑制了禾谷鐮刀菌Fg1的孢子萌發率和胚管長度。蛋白質組學分析表明,差異表達的蛋白質是由一些與基礎代謝有關的基本蛋白質和酶組成的,如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸變位酶(PGAM)、烯醇化酶(ENO)、果糖二磷酸醛縮酶(FBA)等,這些都下調表達。分析了釀酒酵母(S.cerevisiae)對禾谷鐮刀菌(F.graminearum)的轉錄調控。

結論:釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1的控制機制是一種非常復雜的物質和能量代謝過程,其中涉及糖酵解途徑,TCA循環和氨基酸代謝的相關蛋白質和基因全部下調。

引言

赤霉病(FHB),也稱為小麥赤霉病,是世界上廣泛和經濟上毀滅性的疾病,由禾谷鐮刀菌、念珠菌和其他鐮刀屬引起小麥產量損失和品質下降。禾谷鐮刀菌(F.graminearumis)1902年首次發現的小麥赤霉病(FHB)的致病因子,并被證明能產生玉米烯酮(一種由粉紅鐮刀菌產生的霉菌毒素)(ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等真菌毒素。小麥籽粒中ZEN的發生引起了研究者的廣泛關注。ZEN是一種三葉草烯霉毒素,存在于許多糧食作物,特別是小麥、玉米和谷類作物中,可引起人和動物,如豬、牛和小鼠的生殖問題。為了保障消費者的安全,食品和農業組織(糧農組織)將ZEN的臨時最大容許日攝入量(pMTDI)設定為體重的0.5μgkg-1

已經開發了許多方法,例如培育抗病小麥植物,物理凈化劑使用,合理的殺真菌劑,及時收獲和低水分含量,以減少霉菌毒素的毒性。目前,使用的一些物理和化學方法是成功的,但它們也有缺點和有限的效果。傳統的物理方法控制毒素污染存在成本高、時間和資源浪費等缺點。據報道,過量使用化學殺菌劑會對糧食安全和環境造成很大的危害和污染。利用有益微生物或微生物代謝物控制作物病害是一種生物防治策略。有一些成功的例子使用微生物生物防治劑來控制植物病原體的生長和繁殖。用于生物防治的微生物主要是從生態系統中的植物和土壤中分離出來的菌株,包括細菌、真菌和少量具有拮抗作用的放線菌。

本文通過蛋白質組學和轉錄組技術研究了釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1的防治效果以及釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1生長的控制機制。

材料與方法

病原體

從侵染小麥中分離得到到禾谷鐮刀菌Fg1。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基4℃下培養。在隨后的實驗中,在25℃的豆湯培養基上生長禾谷鐮刀菌Fg1。在無菌蒸餾水中,用血細胞計將禾谷鐮刀菌Fg1濃度調節為1×105cell/mL

酵母菌

從葡萄中分離得到釀酒酵母Y-912,并在實驗室進行了鑒定。在營養酵母葡萄糖瓊脂培養基4℃下培養

不同濃度釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1菌絲生長的影響

用無菌沖頭將直徑約5mm的孔制成PDA培養基(30mL)100μL的釀酒酵母Y-912懸浮液(濃度為1×107cell/mL1×108cell/mL1×109cell/mL5×109cell/mL)加入孔內,以無菌水為對照。2h后,將100μL禾谷鐮刀菌Fg1孢子懸浮液(1×105cell/mL)加入孔中。培養皿用塑料包裹密封,然后放置在培養箱中。在溫度和濕度分別為25℃95%的條件下用游標測徑儀測定了禾谷鐮刀菌Fg1菌絲的長度。重復兩次實驗,每一次實驗有三個重復。

不同濃度釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1孢子萌發率和胚管長度的影響

在馬鈴薯-葡萄糖肉湯(PDB)和不含瓊脂的PDA培養基上,測定了釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1孢子萌發率和胚芽管長度的影響。制備100ml20mlPDB培養基的錐形瓶,用1ml釀酒酵母Y-912懸浮液(濃度為1×107cell/mL1×108cell/mL1×109cell/mL5×109cell/mL)處理,并以1mL無菌蒸餾水作為對照。在每瓶中分別加入1mL禾谷鐮刀菌Fg1懸浮液,將禾谷鐮刀菌Fg1調至1×105cell/mL的終濃度。將燒瓶在120rpm25℃下孵育15h。通過顯微鏡觀察大約100個孢子以確定禾谷鐮刀菌Fg1的發芽率,并通過顯微鏡法測量禾谷鐮刀菌Fg1的胚芽管長度。將實驗重復兩次,每次處理重復三次。

蛋白組分析

樣品處理:將未添加釀酒酵母Y-912PDB培養基中培養4d(禾谷鐮刀菌Fg1培養2d,然后加入1mL無菌蒸餾水并進一步培養2d)的禾谷鐮刀菌Fg1作為對照。

樣品量要求:1×109cell/mL

檢測平臺:2-DE凝膠電泳;MALDI TOF/TOF質譜儀;

分析軟件:MASCOT軟件;

轉錄組分析

樣品量要求:0.1g

測序平臺:Illumina Hiseq2500

分析內容:基因注釋、基因表達量;

RT-qPCR

選取6個基因做表達量水平驗證;

結果

釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1PDA培養基中菌絲生長的影響

從圖1可以看出,與對照相比,當在禾谷鐮刀菌Fg1培養基中加入不同濃度的釀酒酵母Y-912時,禾谷鐮刀菌Fg1菌絲的延伸長度顯著降低。隨著釀酒酵母Y-912濃度的增加,禾谷鐮刀菌Fg1菌絲的長度減少。當釀酒酵母Y-912濃度為1×109cell/mL時,禾谷鐮刀菌Fg1的長度為49.51mm。結果表明當釀酒酵母Y-912濃度為5×109cell/mL對禾谷鐮刀菌Fg1菌絲的控制效果最為明顯,長度僅為43.99mm

Fig. 1 Effects of various concentration of S. cerevisiae Y-912 on mycelial extension of F.graminearum Fg1.

1 不同濃度釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1菌絲生長的影響

釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1孢子萌發率和胚管長度的影響

從圖2中可以看出,與對照相比,添加釀酒酵母Y-912后,禾谷鐮刀菌Fg1孢子萌發率和胚芽管長度均顯著降低。隨著釀酒酵母Y-912濃度的增加,禾谷鐮刀菌Fg1孢子萌發率下降。釀酒酵母Y-912濃度為1×109cell/mL禾谷鐮刀菌Fg1的孢子萌發率只有1.93%明顯低于對照組(96.58%)。當釀酒酵母Y-912濃度為5×109cell/mL時,能完全抑制禾谷鐮刀菌Fg1孢子的萌發。

隨著釀酒酵母Y-912濃度的增加,禾谷鐮刀菌Fg1的胚管長度降低。當濃度為1×109cell/mL時,禾谷鐮刀菌Fg1的平均生殖管長度僅為11.63μm,低于對照組(57.17%)。當釀酒酵母Y-912濃度為5×109cell/mL時,禾谷鐮刀菌Fg1的平均生殖管長度僅為7.78μm,而對照組為71.35%

Fig. 2 Effects of S. cerevisiae Y-912 on spore germination rate (A) and germ tube length (B) of F. graminearum Fg1.

2釀酒酵母Y-912禾谷鐮刀菌Fg1孢子萌發率(A)和胚管長度(B)的影響

禾谷鐮刀菌Fg1中差異表達蛋白的鑒定

析了由釀酒酵母Y-912控制的禾谷鐮刀菌Fg1和禾谷鐮刀菌Fg1的全蛋白表達情況。在每個凝膠中檢測到160個差異表達的蛋白質(平均fold change1.5)80個顯著差異表達蛋白質(平均fold change2)。在80蛋白質中,46蛋白質被顯著上調,34蛋白質被顯著下調。然而用質譜(MS)鑒定40個顯著差異表達的蛋白質。這些蛋白質的詳細信息列于表1

Fig. 3 Proteome analysis of the F. graminearum Fg1 (A) and F. graminearum Fg1 controlled by S. cerevisiae Y-912 (B).

3蛋白質組分析

48個差異蛋白點的基本信息進行了分類,包括分子量、等電點和肽匹配。從表1中可以看出,大多數蛋白質與細胞的基礎代謝有關,而有些則是在氧化應激下產生的應激蛋白。結果表明,禾谷鐮刀菌Fg1中的差異表達蛋白是與基礎代謝相關的酶,包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、糖酵解途徑中的烯醇化酶(ENO)(PGAM)果糖二磷酸醛縮酶(FBA)和蘋果酸脫氫酶(MMD)的檸檬酸途徑,以及一些與能量代謝和氨基酸代謝有關的酶,由釀酒酵母Y-912控制的禾谷鐮刀菌Fg1中的這些酶顯著下調。

Table 1 MS/MS analysis identification of differentially expressed proteins in F.graminearum Fg1 and F. graminearum Fg1 controlled by S. cerevisiae Y-912

1差異表達蛋白質列表(部分)

禾谷鐮刀菌Fg1基因的轉錄及功能分析

RNA-Seq技術分析了由釀酒酵母Y-912控制的禾谷鐮刀菌Fg1和禾谷鐮刀菌Fg1的轉錄水平。共檢測到4132(|log2(Fold Change)|>1)DEGs(差異表達基因),其中3318個基因表達上調,814個基因下調。另外,229個基因顯著增加,20個基因顯著下調(|log2(Fold Change)|>2)。這些DEGs按基因功能與基因本體(GO)聚類(5)。生物過程包含14個亞,分子功能包含16個亞。最具活力的GO類別是對生物刺激和防御反應的應。屬于生物學過程范疇的非生物脅迫基因是釀酒酵母Y-912誘導抗性的重要基因。

Fig. 4 GO categorization of differentially expressed proteins in F. graminearum Fg1 and F. graminearum Fg1 controlled by S. cerevisiae Y-912.

4差異表達蛋白的GO分類

Fig. 5 GO enrichment analysis of the differentially expressed genes from F.graminearum Fg1 and F. graminearum Fg1 controlled by S. cerevisiae Y-912.

5差異表達基因的GO富集分析

釀酒酵母Y-912控制的禾谷鐮刀菌Fg1相關基因的相對表達水平

為了驗證這些感興趣的基因在禾谷鐮刀菌Fg1中表達水平的差異,采用RT-qPCR分析了與ZEN合成相關的6個基因的mRNA水平。從圖6可以看出,FG05_10207(脂肪酸基-CoA脫氫酶)FG05_07693(葡萄糖-6-磷酸異構酶)FGSG_04543(葡糖胺-6-磷酸-N-轉移酶)FGSG_10783(內切幾丁質酶)FGSG_02352(檸檬酸合成酶)的表達水平均顯著降低。5種基因的表達水平均顯著降低,分別為對照組的0.65倍、0.7倍、0.4倍、0.5倍和0.5倍。此外,與對照組相比,FGSG_08608(應答調節蛋白)的表達水平顯著上調1.5倍。這些基因表達水平的變化趨勢與轉錄組分析結果一致。

Fig. 6 RT-qPCR validation of the differentially expressed genes.

6 RT-qPCR對差異表達基因的驗證

總結

從總體上看,釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1的控制機制是一個非常復雜的物質和能量代謝過程,從蛋白質組學和轉錄組學的角度來看,由釀酒酵母Y-912控制的禾谷鐮刀菌Fg1的過程參與了糖酵解途徑、TCA循環和氨基酸代謝。微生物的糖酵解是一種常見的代謝途徑,用于碳水化合物轉運、代謝、催化活性、生長和發育,同時為其他代謝產物提供中間體。另一個重要的代謝橋梁是檸檬酸循環,也稱為TCA,這不僅是丙酮酸氧化的通道,也是脂肪酸、氨基酸等燃料分子氧化分解的常見途徑。氨基酸是多種重要的生物氮化合物前體,在正常代謝過程中可轉化為丙酮酸,草酰乙酸,α-酮戊二酸和其他代謝中間體。

然而,該實驗中存在大量蛋白質功能,無法鑒定,也未與禾谷鐮刀菌Fg1的代謝直接相關,ZEN合成的代謝途徑需要進行更深入的分析和探索。為了進一步探索釀酒酵母Y-912對禾谷鐮刀菌Fg1的控制機制中的關鍵蛋白和關鍵調控基因,還需要做大量的工作。


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