幸运飞艇官方开户

服務熱線:025-85381280
技術支持

常見問題匯總(蛋白組學篇)

幸运飞艇官方开户FABURIQI:2019-03-08 LIULANCISHU:627

蛋白質組學是從整體的角度分析細胞內動態變化的蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態,了解蛋白質之間的相互作用與聯系,揭示蛋白功能與細胞生命活動規律的一個新的研究領域。



Q:什么樣的樣本可以做蛋白定性分析?

A:蛋白質溶液、SDS-PAGE條帶(考染、銀染條帶清晰可見)、Western blot目標條帶、雙向凝膠電泳點等樣本,符合送樣要求均可進行蛋白質定性,就樣本不同定性出來的蛋白質數量會有差別。


Q:蛋白全譜分析能鑒定多少蛋白?

A:蛋白全譜分析鑒定的蛋白數與物種、樣本中蛋白質含量及復雜程度、蛋白組分分離程度、數據庫的完整度都有很大的關系。一般情況下,一次全譜分析可以鑒定3000-5000種蛋白;但一般膠條可以鑒定幾種到幾百種蛋白質。


Q:雙向凝膠電泳與質譜聯用鑒定蛋白的過程是什么?

A:通過對蛋白質雙向電泳的圖譜掃描,進行譜圖差異分析,找出差異點切出,進行脫色、酶解、質譜檢測,得到質譜原始數據文件,通過數據庫搜索可以得到差異點蛋白質的詳細信息。


Q:目前可進行蛋白全譜分析的物種有哪些?

A:只要數據庫中該物種或近緣物種的蛋白質組數據趨于完整,基因組序列或轉錄組數據已知,均可進行蛋白全譜分析。對于以上條件不滿足的物種,可在蛋白質組全譜分析的同時,做一個基因組或轉錄組測序,以便為蛋白全譜分析提供支持。因此,理論上所有的物種均可進行蛋白全譜分析。


Q:iTRAQ定量蛋白質組和2-DGE相比,有什么優勢?確實比2-DGE效果更好么?

A:2-DGE是伴隨著MALDI-TOF技術發展起來的蛋白質分離技術,理論上可以通過蛋白質等電點(IEF)和分子量(SDS-PAGE)的差異將總蛋白質逐一分開,但實際情況并不理想,由于低豐度蛋白無法染色成功而導致看不見,蛋白翻譯后修飾后偏離理論位置等等,一張2-DGE能鑒定到的蛋白質總數最多2000種蛋白。而iTRAQ是伴隨LC-MS/MS技術發展起來的蛋白質組定量技術,不用做雙向電泳,同時可以克服2-DGE無法鑒定低豐度和修飾蛋白干擾的情況,一針即可鑒定2000種左右的蛋白(1.5hr),分組上機后,依據不同物種的情況鑒定到的蛋白質數量也有差別。iTRAQ的優勢不僅僅在于定量蛋白質組的數量,還在于單次實驗可以同時做4~8個樣本,降低儀器的系統誤差,保持高通量定量能力。一般的定量蛋白質組實驗,iTRAQ優勢遠遠大約2-DGE,屬于兩個時代的技術。

Q:iTRAQ如何做9個樣品的標記?

A:iTRAQ試劑盒分為4標和8標;4標試劑盒標簽分子量分別為114,115,116,117;而8標試劑盒標簽分子量分別為113,114,115,116,117,118,119,121。由于9個樣品不能用8標的試劑盒同時標記,不建議用兩種試劑盒分別標記,而且有重疊的標簽,一般建議客戶生物學重復2,3,3或者2,2,2。

Q:iTRAQ定量蛋白質組做完實驗后,能拿到什么結果呢?可以直接用來發文章么?

A:我們目前的iTRAQ定量蛋白質組的實驗流程和結果都是受到業內頂級雜志公認的,可以直接用于文章的發表。客戶不僅可以拿到iTRAQ定量蛋白質組中的差異蛋白、蛋白的GO和COG/KOG功能分類信息、KEGG通路分析、不同樣本的差異蛋白的聚類分析、差異蛋白的互作網絡等等,還可以為客戶提供指定的分析內容,提供個性化的服務要求,比如多組學聯合分析:轉錄組和蛋白組,蛋白組和代謝組等等。

Q:關于“樣品重復”,技術重復和上機重復有什么區別?發表的文章一般要求幾次重復呢?

A:一般的文章會要求3個生物學重復,如果iTRAQ后續做了大量的WB或ELISA驗證,那么,2個生物重復也是必要的;僅做1個生物重復有風險,因為如果是實驗過程出現問題,缺乏結果的評估,往往說服力不夠,對文章發表可能構成影響,建議客戶最好不要只作1次重復,至少2次。

技術重復一般和上機重復非常類似,即上質譜的重復,即測試儀器的穩定性,判斷系統誤差等問題。這一說法主要和質譜儀器的發展進程相關,早期的儀器不是很穩定,同一個樣本上機3次,結果差異較大,當前的上機重復仍然在一些JPR和MCP文章中可見,即沿用了早期的習慣。而應用型的文章中,上機重復或技術重復一般沒有硬性規定,可以不做,如果做了當然最好,editor就不會再此處找你的問題。

Q:iTRAQ、SILAC和SWATH等相比,應該選擇哪一種定量的方法呢?

A:目前主流的定量蛋白質組方法有5種,分別是iTRAQ、SILAC、label-free和SWATH。其中最流行的是iTRAQ定量蛋白質組方法,該方法不依賴樣本,可以做任意樣本的總蛋白質的差異定量,而且定量準確;label-free雖然也可以做任意樣本的蛋白質定量,但是不能避免系統誤差,定量準確度難以保障。SILAC是僅僅適用于標記活的可傳代細胞、細菌等材料,不能標記組織、體液等樣本,需要用穩定同位素進行體內標記,耗時較長。SWATH是數據非依賴型(DIA)的第二代蛋白質譜技術,和以數據依賴型(DDA)為基礎的shot-gun法以及SRM法相比,最大的優勢在于獲得蛋白質數據的完整性和精確性,兼具shot-gun法的高通量以及SRM法的可重復性,但是成本非常高。DIA和DDA區別詳細請見“常見問題匯總(代謝組學篇)”。

Q:不同客戶的樣本做iTRAQ定量可否放在一組上機?

A:有些老師比較了解iTRAQ定量蛋白質組的流程,因此,有此問題。我們的專業決定了我們堅決不會將不同客戶的樣本混合到一起上質譜。如果客戶的樣品來自不同物種,那么質譜鑒定的數據庫選擇會不同,無法進行比較。如果是同一個物種的樣品,那么經過不同實驗室處理后,樣品里的蛋白含量和數目會有較大差別,混在一起后會影響兩組不同來源的樣品的蛋白鑒定數目。