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文獻解讀

集思慧遠客戶發表《花椒種子中抗菌肽的發現與鑒定》

FABURIQI:2019-04-24 LIULANCISHU:572

合作單位:四川農業大學

發表期刊:Applied Microbiology and Biotechnology

影響因子:IF=3.34(SCI二區)

研究背景:抗菌肽AMPs是一種重要的宿主防御肽,可以防止天然免疫系統受到病原體的攻擊。到目前為止,根據在線抗菌肽數據庫(APD),已經從細菌、植物、動物和真菌等不同種類中發現了近2980個抗菌肽。AMPs的發現和表征是進一步研究其性質的關鍵。傳統的篩選AMPs的方法通常涉及從復雜食物來源中提取、分離和純化多肽,以及純化成分的鑒定。然而,事實證明,這些過程是耗時、勞動密集型和低收益的。因此,有必要開發更有效的方法來發現AMPs。多肽是蛋白質組學的一個子領域,廣泛應用于肽的識別和表征。

實驗目的:開發一種新的方法,通過多肽組學和生物信息學的方法,從花椒種子中發現蛋白水解物。然后化學合成了潛在的AMPs,并對其抗菌活性進行了測試,并確定已證實的AMP的結構。這項研究為發現AMPs提供一種有效的途徑,同時也證明花椒種子是獲得AMPs的一種自然資源。

實驗取材:利用花椒種子去油干燥后的粉末提取蛋白質,并利用胃蛋白酶獲得蛋白水解物。

實驗內容:多肽組學、抗菌肽合成、抗微生物試驗等。

檢測平臺:UPLC-ESI-MS/MS(nanoACQUITY UPLC system-Q Exactive mass spectrometer )

主要研究結果

01多肽組學定性及定量分析

在本研究中,利用PEAKS軟件對多肽進行了新的序列分析。然后,針對蕓香科UniProt搜索光譜數據,共發現4358個肽,其中數據庫確認序列3137個,新發現序列1221個。在這些多肽中,1436個序列被注釋為70個已知蛋白質的組分,其中以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)為主,其次是蔗糖合成酶(蔗糖合成酶)。多肽的代表性譜圖(NP-6),其序列被確定為AGDKKIKIGINGFGRIGRL,如圖1所示。

圖1 NP-6 MS/MS譜圖

02潛在抗菌肽及抗菌性能

通過使用在線預測服務器,總共預計16種肽,稱為NP-1至NP-16,是潛在的AMPs。表1和表2列出了潛在肽的理化性質和預測評分。如表1所示,所有這些肽的凈電荷為2~4,長度為15~28,分子量為1.5-2.7kDa。表2表明不同的方法有自己的計算策略;預測結果可能彼此不同。例如,NP-2,NP-8和NP-10通過CAMP具有高預測分數,但是通過AntiBP2具有相對低的分數。

表1 nanoUPLCMS/MS法鑒定花椒種子蛋白水解產物的理化性質

表2使用三種基于web的服務器預測潛在抗菌肽的結果


化學合成16種潛在肽,然后通過RP-HPLC系統純化,并通過ESI-MS技術表征。這些多肽進一步測試其對細菌和酵母的抗微生物活性。4個多肽NP-2、NP-5、NP-6和NP-7在檢測濃度范圍內顯示出抑制作用(圖2a)。MIC分析表明,NP-6來源于GADPH,富含甘氨酸,對所有供試菌株均有活性。但NP-2、NP-5和NP-7對這些菌株具有選擇性抗菌活性(表3)。

此外,觀察到多肽NP-7與NP-6共享基序GINGFGRIGRL,但它如何影響兩種肽的活性尚不清楚。此外,NP-6對革蘭氏陰性細菌更有效。考慮到NP-6的廣譜活性,選擇NP-6作為進一步的實驗對象。


圖2 NP-6的抗菌性能

注:a NP-6對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長抑制。b用2×MIC NP-6處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的時效曲線。

表3預測AMPs的抗菌活性


03掃描電鏡分析結果

通過SEM評估NP-6對細菌細胞形態的影響。如圖3所示,與NP-6一起培養的大腸桿菌細胞在表面上顯示出坑洼(圖3c,d),用NP-6處理的金黃色葡萄球菌細胞在表面上具有更多的碎片并且在細胞的中心凹陷(圖3g,h)。

圖3大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的掃描電鏡

注:大腸桿菌的SEM顯微照片:a,b對照;c用NP-6處理。金黃色葡萄球菌的SEM顯微照片:e,f對照;g,h用NP-6處理。中間對數生長的細菌用NP-6以1×MIC處理2h。

04NP-6結構分析

在通過儀器評估結構之前,將NP-6的序列提交給I-TASSER,I-TASSER是蛋白質結構和功能預測的分級方法。預測的NP-6三維模型如圖4a所示。這表明NP-6大部分由無規卷曲和小部分的α-螺旋組成。為了評估NP-6在不同溶劑中的構象,使用CD分光光度法。如圖4B所示,NP-6的光譜是ddH2O中的無序構象,其在200nm附近顯示負的最大值。相比之下,它在50%TFE存在下采用α-helix構型,分別從208和220nm處的兩個負最大值推斷。

圖4 NP-6結構分析

注:a NP-6的預測三維模型。b NP-6在不同溶劑中的CD光譜。

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