幸运飞艇官方开户

服務熱線:025-85381280
文獻解讀

集思慧遠客戶發表《毛白楊葉片和莖尖分生組織中小RNA的鑒定與分析》

FABURIQI:2019-03-20 LIULANCISHU:487

  英文題目:Identification and Analysis of microRNAs in the SAM and Leaves of Populus tomentosa  

  雜志:Forests

  影響因子:IF=1.956

  

  摘要

  莖尖分生組織(SAM)是位于植物頂端的一種重要組織,可持續生長和分化、發育為地上部分。SAM的發育受到一系列復雜的分子調控網絡的控制,其中microRNAs(miRNAs)及其靶基因起著關鍵作用。然而,人們對木本植物中的miRNAs知之甚少。本研究利用小RNA(Srna)測序技術,建立了毛白楊莖尖和成熟葉組織的4個文庫,鑒定了99個已知的miRNA家族。此外,193種已知的miRNA,包括植物激素、發育和細胞過程相關的miRNA,表現出顯著的差異表達。有趣的是,對miR172、miR164和miR 393的qPCR分析顯示在莖尖發育過程中表達模式有顯著變化。這些miRNAs的靶基因參與調節激素反應和干細胞功能。特別是參與維持莖尖干細胞的miR 172靶基因APETALA2(AP2)在發育的初始活動階段就有特異性表達。這些發現對了解miRNAs參與SAM的發展和分化在樹種中的調節機制提供了新的見解。

  

  材料與方法

  植物材料:  毛白楊(20年)的健康莖尖和周圍葉片.選擇了以下三個發展階段:

  圖中綠色框中組織表示用于qPCR測定的組織;藍色框表示用于高通量測序的組織。

  

  方法:  

  形態觀測:切片,顯微鏡觀察  

  sRNA測序與分析:  

  測序平臺:Illumina HiSeq 2500(IA時期每個樣品2個重復,共4個文庫;數據量平均每個文庫12M)  

  分析:GenBank和Rfam數據庫對sRNA進行分類注釋  

  MIREAP預測新miRNA  

  表達量:TPM 

  靶基因預測:psRNATarget和psRobot  

  qPCR分析

  

 結果

  

  1..生長過程中莖尖和葉片形態和解剖結構的變化

  

  

  2.SAM和葉片中sRNAs的序列分析

  

  

  SAM和葉片數據過濾后的sRNAs的總體大小分布

  

  

  3、毛白楊中已知和novel-miRNAs的鑒定

  

  經過序列相似性搜索,確定了349個已知的miRNAs,它們對應于99個miRNA家族。在SAM中,328個已知的miRNAs被分成88個miRNA家族。此外,作者,還分析了已知miRNA家族中的reads數,結果表明這些miRNA家族在表達頻率上存在很大差異,如下圖所示。

  

  

 4、 差異miRNA(DEM)及其靶基因的分析

  

  作者對每一個樣本中miRNA進行了量化,并篩選了在SAM和葉片之間顯著表達的基因 (|log2 fold-change| > 1, FDR < 0.05)。


  

  圖4 差異表達miRNA。(a)已知的和novel-miRNA的差異表達火山圖;(b)SAM和葉片中已知和未知miRNA差異表達聚類圖;(c)已知miRNA與葉片比較上調和下調的種類

  

  5、差異miRNA與莖細胞功能相關

  

  miRNA調解對激素響應起著重要作用。作者對靶基因為AP2、CUC2 , 和ATHB-15 的miRNA進行了分析。

  圖5.差異表達miRNA及靶基因AP2(a,b)、CUC2 (c,d), and ATHB-15 (e,f)的熱圖和網絡圖。在熱圖中,顏色表示SAM和葉片中miRNA的log10TPM值。紅色代表高表達,藍色代表低表到,×代表不表達。

  

  6、miR172及其靶基因的表達

  

  以上分析內容顯示,miR172在兩組織中特異表達,作者做了該家族及其靶基因在SAM和葉片的三個時期的qPCR。

  圖6 miRNA及其靶基因。(a)miR172在毛白楊AP2轉錄本上的靶位點及保守區域;紅色框代表AP2/EREBP的兩個保守域;(b-d)qPCR分析miRNA(b)及其靶基因的表達(c,d)。

  

  7、其他miRNA的qPCR驗證

  

  為了驗證從高通量測序中獲得的miRNA的表達模式,作者用qPCR分析了10個已知miRNA和3個新miRNA來驗證sRNA-seq的結果。

  圖7.高通量測序所得miRNA表達的確認。

  

  討論

  

  本文亮點在于對已有數據挖掘很到位,qPCR驗證不僅對關注miRNA及其靶基因進行了驗證,也進行了隨機驗證。但對于關鍵miRNA的驗證工作文章只進行了qPCR驗證作,如果有RNA-seq數據或者進一步進行功能驗證,會更完整,也更有說服力。