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文獻解讀

集思慧遠客戶發表文章《聯合轉錄組學和蛋白組學數據分析揭示了赭曲霉毒素A在青霉素中通過pH調控生物合成》

FABURIQI:2019-03-20 LIULANCISHU:514


  合作單位:江蘇大學  

  發表雜志:RSC Advances  

  影響因子:3.108

  

  研究背景  

  赭曲霉毒素A(OTA)由于侵染了曲霉屬和青霉屬的絲狀物種而在各種植物和動物中被發現,OTA被國際癌癥研究機構(IARC,1993)歸類為人類潛在致癌物(2B組),其呈現腎毒性,肝毒性,神經毒性,致畸性和免疫毒性;因此,它對人類和動物具有潛在危害。OTA是一種常見的霉菌毒素,包括谷物,葡萄,咖啡,堅果,香料,可可豆以及通過這些物質加工而成的各種食品及其制品。葡萄及其衍生物是繼谷物之后受OTA毒害最嚴重的物種。OTA在地方性腎病病因學中的作用及其與泌尿道腫瘤的關系也得到了證實。OTA由細胞色素P450酶和過氧化物酶酶活性引發的自由基形成苯醌親電體。OTA由于其穩定性高而對人體特別有毒。基于OTA的強毒性和致病性,一些組織機構已經規定了食品中OTA含量的最高水平和指導方針。

  產生OTA的菌株主要包括青霉屬和曲霉屬,少數石座菌屬和枝孢菌屬菌株。OTA生成速率受底物污染物種類,環境條件和地理區域的影響。在溫帶氣候條件下,OTA主要由青霉屬產生,而熱帶和亞熱帶地區則由曲霉菌種產生。

  

 材料與方法

  從被感染的葡萄中分離出桔青霉菌X9-4,菌種在不同pH條件下培養兩周后獲得菌絲體和孢子,并進行蛋白質和RNA提取。OTA測定:Agilent ZORBAX SB-C18反相高效液相色譜。

  

  蛋白質組學

  分離:等電聚焦和二維凝膠電泳  

  檢測平臺:HPLC-ESI-TOF-MS/MS  

  基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)

  轉錄組測序

  檢測平臺:illumina Hiseq2500  

  反轉錄和實時定量PCR

  反轉錄試劑盒:Thermo Scientific

  實時熒光定量:SYBR Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa, Dalian, China);ABI StepOnePlus Real-Time PCR Systems(Applied Biosystems, CA, USA)

  

  結果與討論

  1. pH對菌株X9-4的生長和OTA產生的影響

  

  

  圖1 不同pH值下桔青霉菌的菌落直徑和OTA產量

  

  菌株生長的pH范圍較寬,但堿性環境不適合其生長。在pH值為11時,菌落直徑為12 mm,是pH值為7的培養基的一半,其中pH7是菌落生長最有利的pH值。相比之下,當培養基的pH在3和9之間時,菌落直徑非常接近。關于pH對菌株產生毒素的影響,在pH5和9的培養基中毒素產生率較高,并且在pH5時毒素的最高濃度為25.6ng g-1。另外還觀察到當菌株在pH 3下培養時,沒有檢測到OTA;這表明其在酸性環境中的生物合成被抑制。

  

 2. 參與生物合成的蛋白質在不同pH條件下的相對表達

  

  為了研究酸性環境如何抑制OTA生物合成的機制,提取了pH 3和5培養的桔青霉菌的總蛋白質。如圖2所示,使用PDQuest在每個凝膠上總共檢測到300個蛋白質,其中90個為差異表達蛋白質,并且通過MALDI-TOF / TOFMS鑒定25個最佳分辨的斑點(表1)。

  

  

  圖2 在不同pH值培養的桔青霉菌總蛋白質的二維圖譜

  

  表1 MS / MS分析鑒定的pH 3和pH 5下培養的桔青霉菌不同表達的蛋白質

  

  

  3.差異表達蛋白分析

  

  

  圖3 不同表達蛋白斑點的功能分類

  

  桔青霉菌桔合成OTA可能與基礎代謝相關(圖3)。當桔青霉菌在pH5下培養時,代謝和合成相關蛋白上調表達,如:果糖-二磷酸醛縮酶(FBA,斑點11和4)和核苷-二磷酸-糖差向異構酶。當桔青霉菌在pH5下培養時,轉醛醇酶(斑點14)下調表達。因此轉醛醇酶的下調表達可以減少桔青霉菌中OTA合成所必需的丙酮。

  

  能量對于OTA的生物合成至關重要,PP途徑是提供NADPH的重要來源。當菌株在pH 5下培養時,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH,斑點25)的表達降低。也就是說,當菌株在pH 3下培養時,PP途徑更具活性。轉酮醇酶(斑點21)是磷酸戊糖循環中的重要酶,并且減少磷酸焦磷酸酯周期,以焦磷酸硫胺素和鎂離子作為酶活動基。磷酸丙糖異構酶(斑點10)催化丙糖磷酸酯異構體在磷酸二羥丙酯和D型甘油醛3-磷酸之間轉化,在糖酵解過程和能量供應中有至關重要的作用。然而,在pH 5條件下,磷酸丙糖異構酶的表達下降。腺苷酸激酶(斑點19)是能量代謝中重要的酶,其催化三磷酸腺苷(ATP)導致腺苷單磷酸(AMP)和二磷酸腺苷(ADP) 磷酸化。在pH5培養時,涉及能量代謝的兩種蛋白質上調表達:磷酸丙酮酸水合酶和氨基酸轉運蛋白ATP結合亞基。通過糖酵解甘油酸(PGA) -烯醇磷酸酯型丙酮酸(PEP)的不良反應將PEP轉化為PGA,參與糖異生過程中的磷酸蝶呤水合酶(斑點24),在細胞能量代謝過程中發揮重要作用。磷酸腺苷蛋白亞基(斑點18)參與生物能量的生成過程,二肽磷酸腺苷參與合成dTDP-4-乙酰胺基-α-D-海藻糖(dTDP-N-乙酰異氨基苯甲胺)。在酸性條件下,一部分參與能量代謝的蛋白質上調表達,其他蛋白質在菌株X9-4中下調表達。

  

  6PGDH(斑點25)在PP途徑中的代謝過程中產生一種稱為NADPH的物質,可以保護細胞免于氧化。因此,6PGDH參與能量代謝并引起壓力。醛脫氫酶(斑點23)在提高生物體抗性方面起重要作用。有研究表明在低溫脅迫下,遺傳修飾(SoBADH基因)菌株表現出較高的醛脫氫酶活性,并且顯著改善抗凍性能。還有差異表達的蛋白質,如70 kDa熱激蛋白(斑點3)與免疫反應相關。

  

  產生的毒素需要通過載體排出。在pH 5的培養條件下,谷胱甘肽S-轉移酶39(GSTs,斑點8)表達上調。GST是廣泛分布于各種生物體中的一組多功能同功酶,其功能包括與巰基還原型谷胱甘肽物質的親電基團的偶聯;這使得它通過增加其物質疏水性而更容易穿過細胞膜。據觀察,GSTs上調表達的酶和OTA生產效率呈正相關,當GSTs酶上調表達時,桔青霉菌中OTA的濃度增加。ABC轉運蛋白(斑點9)是一種跨膜蛋白質,其廣泛存在于各種生物體中,從細菌到人。其主要功能是利用ATP將底物與細胞結合。在pH5培養條件下上調的SAM(無菌Alpha基序)功能域(斑點12)是蛋白質模型之間相互作用的蛋白質,例如p63和p73的C末端的SAM功能結構域通過結合其他 蛋白效應物器來調節p63和p73的功能。

  

  4. 不同PH條件下OTA生物合成相關基因的相對表達

  

  通過測序,得到桔青霉菌轉錄組數據(表2),共9.91GB,用于后續的分析。  

  表2 測序統計結果  

  

  OTA合成能力的差異可能由基因表達差異引起;因此,必須研究在pH 3和5培養的桔青霉菌中差異表達的基因。通過對比,我們在兩組樣品中發現2200個差異表達基因(差異倍數≧2,FDR<0.05);其中,1024個基因表達上調,1176個下調。P3_vs_P5用于差異表達基因的分類,樣本組P5較樣本組P3中上調基因的表達更高,反之亦然。

  

  為了分析這些不同表達基因的功能,進行了GO和COG注釋和分類(圖4)。通過GO三個功能分類,進一步將4545個非冗余基因分為57個類別;許多unigenes同時被分配到不同的類別。然后,計算每個類別的DEG unigenes的百分比。這些結果表明,OTA在桔青霉菌中產量差異可能是由于這些類別中的幾個不同表達的基因。

  

  不同pH值下培養的桔青霉菌轉錄組數據分析顯示,由于一些代謝途徑相關酶的低表達而導致酸性pH抑制毒素合成。此外,酸性環境下培養的桔青霉菌抑制了參與毒素生物合成調控的一些基因的表達水平;這也可以減少毒素的合成。DEGs GO分類最豐富的類別,包括氨基酸轉運和代謝,碳水化合物的運輸和代謝,無機離子轉運和代謝,次生代謝產物的生物合成以及能量和供應代謝。這些不同表達的基因可能參與合成和OTA調節過程。

  

  圖4 桔青霉菌中DEG的功能分類

  

  為了驗證與OTA合成相關基因的表達差異,通過RT-qPCR分析了14個差異表達基因的轉錄水平,這些不同程度表達的基因與OTA合成相關(圖5)。從pH 5條件下培養的桔青霉菌的結果可以看出,這些基因的表達水平明顯高于在pH 3培養的菌株的表達水平。這些結果與轉錄組數據分析結果一致。

  

  圖5 通過RT-qPCR驗證不同表達的基因

  

  總之,結果表明,低pH條件抑制桔青霉菌中OTA的生物合成。蛋白質組學技術用于研究不同pH值培養條件下桔青霉菌中不同表達的蛋白質。結果表明,與pH 3條件相比,在pH 5培養基中有11種蛋白質表達上調,占蛋白質總數的44%。相比之下,大多數堿性代謝和合成相關蛋白以及與能量供應相關的蛋白質的表達水平都有所降低;這使得細胞很難維持生命活動。果糖二磷酸醛縮酶,丙酮磷酸酯酸水解酶,腺苷磷酸亞單位,谷胱甘肽S-轉移酶活性在低pH(3)培養的桔青霉菌中均降低。果糖-二磷酸醛縮酶對器官系統提供ATP和底物,另外,谷胱甘肽S-轉移酶可能與毒素轉運相關。在低pH3條件下,果糖-二磷酸醛縮酶和谷胱甘肽的表達水平有限,而應激相關蛋白(如一些信號轉導和脫氫相關蛋白)的表達增加。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的表達水平在低pH3條件下增加,這使得菌株免受壓力。

  

  總結  

  通過對不同pH條件下培養的桔青霉菌轉錄組數據的分析,發現了OTA生物合成和代謝調控的機制。在pH3和5條件下,鑒定出19,598個差異基因。結果表明,一些基因在桔青霉菌的OTA合成中起重要作用。這些基因主要編碼乙酰轉移酶,聚酮合酶磷酸酯通用酰基半胱胺聯合結構域,酰基輔酶A氧化酶,醇氧化酶,NAD(P)結合蛋白,乙酰木聚糖酯酶,細胞色素P450,ABC轉運蛋白,β酮酶結構域蛋白質,轉酮醇酶,醛醇酶和醇脫氫酶。此外,桔青霉菌的轉錄組數據不僅揭示了OTA合成和分子調控的可能機制,而且為控制OTA合成提供了科學指導。

  

  參考文獻:  

  Integration of transcriptome and proteome datareveals ochratoxin A biosyn thesis regulated by pH in Penicillium citrinum. RSC Advances.2017.