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文獻解讀

集思慧遠客戶發表文章《比較轉錄組分析揭示沙梨和互生交鏈孢霉的互作關系》

FABURIQI:2019-03-20 LIULANCISHU:465

  摘要:  

  沙梨(Pyrus pyrifolia)生產的主要限制因素是由死體營養型真菌-互生交鏈孢霉引起的黑斑病。然而,梨對互生交鏈孢霉的分子水平反應機制未知。本文研究了抗性品種Cuiguan(CG)和易感品種Sucui1(SC1)對互生交鏈孢霉感染的宿主響應。使用RNA-Seq技術在互生交鏈孢霉感染的早期鑒定了CG和SC1之間的大量差異表達基因(DEGs)。K-mean聚類和Mapman分析顯示,易感品種SC1中,參與乙烯(ET)生物合成和ET信號通路的基因(如ACS、ACOs、ERFs),以及過敏反應(HR)和程序性細胞死亡(PCD)的基因顯著富集。抗性品種CG中,接種真菌后,響應過氧化氫和超氧化物的基因上調。SC1中,ET水平極高。CG中,解毒酶(例如過氧化氫酶)活性更高。研究結果表明,ET- / H2O2介導的PCD和解毒過程在梨和互生交鏈孢霉的互作中發揮重要作用。

  

  材料與方法:  

  材料:七年生的沙梨樹(Pyrus pyrifolia)“Cuiguan”(CG)和“Sucui 1”(SC1),從果園收集葉子用于接種測定。  

  取材方法:25℃下,互生交鏈孢霉在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上的生長7天。用蒸餾水漂洗菌絲體獲得分生孢子懸浮液。用針刺穿葉的近軸表皮,沿中心靜脈的兩側形成四個感染部位,并接種。用滅菌蒸餾水作為模擬對照。將接種和模擬處理的葉在25℃的黑暗條件下孵育。接種后每天評估真菌生長過程的疾病嚴重性和疾病發生率。每次處理使用至少20片葉。實驗重復5次。在接種后0,1,2,3和5天收集葉子用于RNA-seq。

  

  測序策略和分析流程:  

  測序:Illumina HiSeq2500。PE 100bp。每個時間點混合10片葉子,設置3個生物學重復。共30個樣本。  

  分析:序列處理和差異表達基因分析;

  

  激素測量:氣相色譜儀監測ET(乙烯)釋放;  

  H2O2、O2-和抗氧化酶活性測量;

  qRT-PCR分析;

  

  結果:

  

  1、 在CG和SC1上接種A. alternata  

  (A)接種A. alternata的CG和SC1的代表性表型。  

  (B)CG和SC1分枝頂部的第四葉的病害發生率(具有擴大病變的接種部位的百分比)。

  (C)CG和SC1分枝頂部的第四葉的疾病嚴重性(擴張損傷的直徑)。

  

  

  2、 RNA-Seq轉錄組數據的序列比對和表達分析

  

  在接種后不同時間點,30個樣品中比對到沙梨和A.acalata參考基因組的比率。

  

  集思慧遠客戶發表文章《比較轉錄組分析揭示沙梨和互生交鏈孢霉的互作關系》-Frontiers in Plant Science-2017,IF=4.495

  

  在給定時間點CG和SC1中的獨有和共有的差異上調(A)和下調(B)的unigenes個數。

  

  

  3、 時間表達譜分析

  

  通過k-mean分析,5個階段前10個GO term的基因的表達譜。

  (A)CG中上調;(B)CG中下調;(C)SC1中上調;(D)SC1中下調。

  與過氧化氫、超氧化物、碳水化合物的響應相關的基因在抗性基因型CG中顯著上調,但在易感基因型SC1中不顯著上調。JA、ABA介導的信號傳導途徑和反應創傷和ET在SC1中的顯著上調,在CG中下調。包括“光合作用”、“多糖生物發生”、“細胞壁組織”的生物過程在SC1中顯著下調。

  

  

  4、 轉錄因子分析

  

  顯示CG和SC1對生物脅迫的轉錄反應。使用Mapman軟件顯示具有顯著差異表達的基因,并分成不同功能類別(BIN)。藍色表示減少,紅色表示增加。

  

  

  5、 乙烯含量鑒定

  

  在給定時間點,測量CG和SC1的接種葉中ET水平。在SC1中,ET水平比CG高得多。1dpi后持續增加,在5dpi達到峰值。

  

  6、 激素生物合成途徑的基因表達

  

  CG和SC1中響應A. alternata感染的乙烯合成基因ACO1(A)和茉莉酸合成基因AOC(B)的表達。

  

  7、 H2O2和抗氧化酶的活性分析

  

  CG和SC1中響應A. alternata感染的H2O2和抗氧化酶的活性。在給定時間點測量CG和SC1的接種葉中O2-(A)、SOD(B)、H2O2(C)和CAT(D)的水平。

  

  8、 qPCR驗證

  

  通過qPCR驗證CG(A)和SC1(B)的RNA-seq數據。

  

  9、 模擬ET和H2O2介導的通路,確定沙梨和A. Alternata的相互作用

  

  當沙梨遇到病原體時,ET生物合成(ACS,ACO)和ET信號通路(ERF)被觸發,并且誘導H2O2和O2-產生。因此,發生過敏反應(HR)和程序性細胞死亡(PCD),并成功感染SC1。ET生物合成和ET信號通路被抑制時,誘導CAT將H2O2分解成水和氧。隨后,CG對病原體進行抗性應答。R,抗性基因型CG;S,易感基因型SC1;紅色,上調表達或酶水平升高;綠色,下調表達或酶水平降低。

  

  

  亮點分析:  

  本文分析了互生交鏈孢霉感染沙梨期間的過敏反應和程序性細胞死亡、乙烯生物合成的作用、抗氧化酶的作用,最終揭示了沙梨對互生交鏈孢霉感染的抗性反應。