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文獻解讀

集思慧遠客戶發表文章《通過RNA-seq鑒定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3脅迫應答基因》

FABURIQI:2019-03-20 LIULANCISHU:428

  摘要:

  土壤堿度是作物生產力和質量的主要非生物限制因素。野生大豆(Glycine soja)被認為比栽培大豆(G.max)更具脅迫耐受性,并且對于增加大豆的堿性耐受性有相當大的遺傳變異。在這項研究中,通過RNA測序,分析了堿性耐受的野生大豆品種N24852在90mM NaHCO3脅迫12小時和24小時的根的轉錄組。與對照相比,在NaHCO3處理12小時和24小時后,共鑒定了449個差異表達基因(DEGs),包括95個和140個上調基因,108個和135個下調基因。14個DEGs的定量RT-PCR分析顯示與RNA測序結果的高一致性。與轉錄因子和轉運蛋白相關的GO富集分析顯示,在NaHCO3脅迫后12小時和24小時顯著富集上調基因。核因子Y亞基A(NF-YA)轉錄因子在NaHCO3應激后12小時富集,堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)、乙烯反應因子(ERF)、三螺旋和鋅指(C2H2、C3H)轉錄因子在NaHCO3應激后12和24小時發現。與ABC轉運蛋白、鋁激活的蘋果酸轉運蛋白(ALMT)、谷氨酸受體(GLR)、硝酸鹽轉運蛋白(NRT)/質子依賴性寡肽(POT)家族、S型陰離子通道(SLAH)等離子轉運蛋白相關的基因在NaHCO3處理后24小時富集上調基因,這意味著它們在堿性條件下維持大豆根中的離子穩態。KEGG通路富集分析顯示“苯丙素類生物合成”和“苯丙氨酸代謝”途徑可能參與大豆對堿脅迫的應答。這項研究為進一步調查碳酸氫鹽脅迫應答基因的功能和大豆耐堿性的分子基礎提供了根據。

  

  材料與方法:

  材料:野生大豆(Glycine soja)。  

  取材方法:對129個大豆品種初步篩選,鑒定出耐堿性野生大豆品種N24852。大豆種子用1%次氯酸鈉表面滅菌30秒,并用去離子水沖洗三次。將二十粒種子播種在裝有干凈石英砂的塑料盆中。發芽后7天,將幼苗稀釋至每盆四株植物。將四個罐放置在含有1.5L新鮮1/2濃度的Hoagland營養液(pH≈6.5)的塑料容器中,其可通過底部的小孔吸收營養液。當出現第二個三小葉(種植后約14天)時,施加包含90mM NaHCO3(最終pH為8.5,通過加入KOH調節)的處理溶液以誘導堿性脅迫。對照不含NaHCO3。實驗設置三個生物學重復。處理12和24小時后,收集根尖(3cm),液氮中冷凍并儲存在-80℃用于提取RNA。剩余的根組織和葉,用于測量離子濃度。

  

  測序策略和分析流程:

  測序:Illumina HiSeq2500。共12個樣本。原始reads共283.6M。clean reads共270.5M。  

  分析:比對到大豆參考基因組:Tophat2 (v2.0.13);  

  基因表達水平標準化為FPKM:Cufflinks v2.2.2;  

  DEGs鑒定:R package DESeq;

  基因功能注釋數據庫:Nr (NCBI non-redundant protein sequences);Pfam (Protein family);KOG/COG (Clusters of Orthologous Groups of proteins);Swiss-Prot (A manually annotated and reviewed protein sequence database);KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes);GO (Gene Ontology)。

  功能注釋軟件:BLASTn (v 2.2.26) software;hmmscan (v 3.0) software;

  

  結果:

  

  1、 野生大豆N24852對NaHCO3脅迫的表型和生理反應

  N24852和Lee68在對照(CK)和堿性脅迫下的離子濃度和比率。  

  根中(A)Na+濃度,(B)Na+/ K+比率,(C)Na+/ Ca2+比率。

  葉中(D)Na+濃度,(E)Na+/ K+比率,(F)Na+/ Ca2+比率。

  低Na+濃度的維持和Na+/ K+和Na+/ Ca2+的低比率被廣泛用作植物耐鹽性的指數。為了評價野生大豆N24852的堿度耐受性,使用耐鹽大豆品種Lee 68用于比較。野生大豆N24852對NaHCO3脅迫表現出比Lee 68更大的耐受性。在NaHCO3處理后,兩種大豆品種根中Na+的濃度,Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例增加,但野生大豆N24852根中Na+濃度、Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例顯著低于Lee 68。N24852葉片中Na+濃度,Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例也低于Lee68。

  

  

  2、 NaHCO3脅迫下大豆根中差異表達基因(DEGs)的鑒定

  

  堿性脅迫和對照之間差異表達的基因(DEG)的維恩圖。  

  A12h:12h的堿性脅迫;A24h:24h的堿性脅迫。  

  與對照相比,NaHCO3脅迫下野生大豆根中總共有449個基因差異表達。在堿性脅迫12小時和24小時后,分別有95個和140個上調的基因、108個和135個下調的基因,在24小時堿性脅迫后檢測到更多的DEGs,意味著24h后發生更多的轉錄變化。

  

  

  3、 在兩個時間點(12h和24h)均存在的差異表達基因(DEGs)的熱圖

  

  在兩個時間點,9個基因上調,20個基因下調,表明它們在大豆對NaHCO3應激反應中的重要性。重疊的上調基因包括兩個鋁激活蘋果酸轉運蛋白(ALMT)基因和一個編碼胚胎后期富集蛋白(LEA)的基因。已報道ALMT轉運蛋白在植物對非生物脅迫的適應中起作用,而LEA蛋白的積累是響應由干旱、高溫、鹽度引起的水分虧缺。

  

  

  4、 DEGs的功能分類和GO富集分析

  

  NaHCO3脅迫12小時(A)和24小時(B)的上調基因的GO富集分析。帶有ID的GO號寫在框中。彩框差異顯著,白框不顯著。  

  在12小時的堿性脅迫下,具有轉錄因子活性的基因顯著富集。  

  在24小時的堿性脅迫下,具有轉運蛋白活性、碳水化合物結合的分子功能、參與生物過程轉運的基因顯著富集。

  

  

  5、 基因表達水平的RNA-seq和qRT-PCR結果比較分析

  

  (A)90mM NaHCO3脅迫后12h的14個基因(四個POD-過氧化物酶編碼基因,三個在兩時間點均上調的基因,兩個在兩時間段均下調的基因,五個僅在一個時間點上調或下調的基因)的log2倍數變化;  

  (B)90mM NaHCO3脅迫后24h的14個基因的log2倍數變化;  

  (C)RNA-seq(x軸)和qRT-PCR(y軸)獲得的log2倍數變化的比較,顯示高度一致性。

  

  

  6、 轉錄因子相關的DEGs

  

  12h(A)和24h(B)的NaHCO3處理的差異表達基因(DEG)的轉錄因子家族。共130和173個轉錄因子(TF)分別在NaHCO3脅迫后12h和24h差異表達。在差異表達的轉錄因子中,在兩個時間點都發現堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)、乙烯反應因子(ERF)、三螺旋和鋅指(C2H2、C3H)家族。核因子Y亞基A(NF-YA)家族在NaHCO3應激后12小時富集。這些轉錄因子已經被報道在植物對非生物脅迫的應答中起作用。

  

  

  7、 離子轉運相關的DEGs

  

  已報道ABC轉運蛋白、ALMT家族、谷氨酸受體(GLR)、硝酸鹽轉運蛋白(NRT)/質子依賴性寡肽(POT)家族和S-型陰離子通道(SLAH)在離子轉運中起作用,保持植物對NaHCO3脅迫的響應中的離子穩態。9個轉運蛋白基因在NaHCO3脅迫后12小時差異表達(表1)。在NaHCO3脅迫后24小時,富集轉運相關基因。24個轉運基因上調,3個轉運基因下調,包括編碼ABC轉運蛋白、ALMT、銨轉運蛋白、水通道蛋白轉運蛋白、陽離子外排子家族、GLR、NRT/ POT家族、SLAH、硫酸轉運蛋白和鋅/鐵轉運蛋白。研究結果表明這些轉運基因在維持大豆對NaHCO3應激反應的穩態離子的重要性。

  

  

  亮點分析:

  

  1、在本研究中,鑒定了耐堿性野生大豆品種N24852,其在NaHCO3脅迫下在葉和根中顯示低的Na+濃度。  

  2、這項研究提供了一系列的NaHCO3應激反應基因,以幫助進一步了解植物對堿性脅迫的反應。

  

  參考文獻:

  

  Identification and Analysis of NaHCO3 Stress Responsive Genes in Wild Soybean (Glycine soja) Roots by RNA-seq.  

  Frontiers in Plant Science-2016,IF=4.495