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文獻解讀

集思慧遠客戶發表文章《與小麥抗白粉病基因 Pm48 緊密連鎖分子標記的開發》

FABURIQI:2019-03-20 LIULANCISHU:432

  摘 要:Pm48 為本實驗室鑒定的一個抗白粉病新基因。為精細定位該基因,利用混池 ddRAD 測序鑒定了 81 個與該基因關聯的序列,開發了 STS 標記 Xmp931,轉化了 CAPS 標記 Xmp928、Xmp930 和 Xmp936;同時,利用粗山羊草基因組序列開發了 71 個基因組 SSR 標記, 定位了其中的 Xmp1089 和 Xmp1112。 在 115 個寧糯麥 1 號′Tabasco 衍生的 F2:3 家系中, Xmp928  

  與目的基因共分離,Xmp1112 位于近著絲粒方向處距抗病基因 3.1 cM。在 671 個純合感病家系中,標記 Xmp928 仍與目的基因共分離。利用 3 個中國春 5DS 缺失系,最終將 Pm48 定位在小麥 5DS 上 0.63–0.67 的臂區段中。  

  關鍵詞:小麥;抗白粉病基因;分子標記;混池 ddRAD 測序

  

  1 材料與方法

  

  1.1 試驗材料

  利用抗小麥白粉病的德國品種 Tabasco 與本實驗室培育的糯性感病品種糯麥 1 號,經雜交和自交獲得 4129 個寧糯麥 1號×Tabasco F2 單株,用于抗性遺傳分析;從 436 個 F2:3 家系[19]中隨機選擇 115 個家系組成分離群體用于新開發分子標記的多態性分析和定位。

  利用“中國春”及其缺失系 del5DS-1、 del5DS-2 和 del5DS-5 進行目標分子標記的染色體臂定位, 其中 del5DS-1 保留有 5DS末端 63%長度,缺失了 37%的染色體長度,del5DS-5 保留有染色體 5DS 末端 67%長度,缺失了 33%的染色體長度, del5DS-2保留有 5DS 末端 78%長度,缺失了 22%的染色體長度[21]。

  

  1.2 抗病性評價方法  

  參考高海東等[19]報道的方法評價白粉病抗性。將小麥種子播在 72 孔的穴盤,親本品種及家系各播種 15~20 粒,每穴盤隨機種植 9 粒感病對照蘇麥 3 號。于幼苗一葉期人工接菌孢子,菌種為南京地區流行的 Bgt18。在人工智能氣候室(14 h 光照/10 h 黑暗, 18~22℃, 相對濕度 80%~90%)中培養接種后的麥苗。接種后 7 d 天當感病對照表現出明顯病癥時調查病情,按盛寶欽[22]的 0~4 級分類方法記錄,即 0 級為免疫,植株無病斑,0;級為壞死反應,葉片有枯死斑,1 級為高抗,病斑直徑小于 l mm,菌絲層稀薄可見綠色葉面,偶見較大病斑,但仍透綠,產孢量極少,2 級為中抗,葉片病斑直徑小于 l mm,但菌絲層較厚,不透綠,能產生一定量孢子,3 級為中感,葉片病斑多,且直徑大于 l mm,菌絲層厚,產孢量大,但病斑不連片,4 級為高感,葉片病斑直徑大于 l mm,菌絲層厚,產孢量多,病斑連片。

  

  1.3 分子標記開發

  

  1.3.1 基于 ddRAD 測序獲得的序列  

  根據前期 F2:3 家系的分子鑒定結果[19],從中隨機選取 50 個純合抗病家系和 50 個純合感病家系,每家系選取 8 株, 將其 DNA 等量混合構建抗池(BR)和感池(BS),由南京集思慧遠生物科技有限公司進行 ddRAD測序。根據抗感池序列 SNP 是否產生酶切位點差異,決定轉化成 CAPS 或 dCAPS 標記。如果抗、感池間的 SNP 存在酶切位點的差異,則直接將該 SNP 標記轉化成 CAPS 標記,即在 SNP 位點兩側設計引物,并利用相應的限制性內切酶進行酶切;如果抗、 感池間的 SNP 不存在酶切位點的差異, 則利用軟件 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和 Primer5.0 將 SNP 轉化成 dCAPS 標記,即在引物中引入錯配與 SNP 位點形成新的酶切位點。新開發的多態標記信息見表1。

  

  1.3.2 基于粗山羊草基因組序列

  高海東等[19]鑒定出 Pm48 的緊密連鎖標記 Xmp510。本研究利用 Xmp510 序列及 ddRAD測序獲得的多態標記序列,在線搜索比對粗山羊草標記序列(http://probes.pw.usda.gov/WheatDMarker/phpblast/blast.php)。先對相應的粗山羊草基因組序列進行 SSR 篩查,然后用 MACVECTOR V8.0(Accelrys, UK)設計引物,并進行親本及抗感池間多態性篩選。新開發的多態標記信息見表 1。

  

  

  1.4 分子標記分析  

  參照 Ma 等[23]報道的 SDS 法,從小麥嫩葉中提取總 DNA,–4℃保存。在 SENSOQUEST LABCYCLER PCR 儀(德國)上擴增,反應體系為 10 μL,包括 1× buffer 10μL (含 MgCl2 15 nmol),DNA 模板 1 ng,左、右引物各 2 pmol,2 nmol 的 dNTPs,1 U Taq 酶。PCR 程序為 94℃預變性 5 min,然后按 94℃變性 30 s、50~60℃退火 45 s、72℃延伸 50 s 進行 36 個循環擴增,最后 72℃延伸 7 min。擴增產物經 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染法顯色。  

  CAPS 標記選擇特定的限制性內切酶(TaKaRa),如 Alu I、Acc I、Mae II、Hpy 188I 和 Taq I,按生產商說明書進行酶切反應,反應體系 8 μL,含 PCR 產物約 50 ng,于 37°C 或 65°C (依酶特性而定)過夜,用 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測酶切產物。

  

  1.5 遺傳圖譜構建

  

  采用 Mapmaker 3.0b/EXP[24]和 MapDrawV2.1[25]構建連鎖圖譜,選用 Kosambi 函數[26]計算遺傳距離,連鎖判斷 LOD 閾值設為 3.0。

  

  2 結果與分析

  

  2.1 與 Pm48 連鎖分子標記的開發及定位

  對抗池、感池進行 ddRAD 測序,獲得 81 個可能與 Pm48 關聯的 SNP 序列,將其中 14 個關聯性強的 SNP 標記轉化為STS 或者 CAPS 標記。其中,Xmp931 在抗、感親本間有多態性,且與抗、感池表現一致;Xmp928 (圖 1-A)、Xmp930 (圖 1-B)和 Xmp936 經相應的限制性內切酶酶切后,在抗、感親本以及池間表現一致多態性。利用這 4 個新開發的標記檢測 115 個F2:3 家系,結果 4 個標記均被定位于 Pm48 的遺傳圖譜上,其中 Xmp928 與目標基因共分離,Xmp931、Xmp936 和 Xmp930位于遠著絲粒的一側,與目標基因分別相距 7.8、9.7 和 15.7 cM (圖 2-A)。

  

  

  利用已定位 Pm48 連鎖標記序列信息,比對粗山羊草基因組序列,開發了 71 個 gSSR 標記,其中 Xmp1089 (圖 1-C)和Xmp1112 (圖 3)在抗、感基因型間存在多態性,并且被整合到 Pm48 連鎖圖譜中,距 Pm48 分別為 3.1 cM 和 10.8 cM (圖 2-A)。

  

  

  2.2 Pm48 的染色體臂定位

  利用 3 個中國春 5DS 缺失系對 Pm48 進行染色體臂定位,結果顯示 Xmp1112 位于小麥 5DS 0.63~0.67 的染色體區段(圖3),在該染色體區段中已定位標記 Xcfd81 [19],同時連鎖圖譜顯示 Pm48 位于這兩個標記之間(圖 2-A),因此認為 Pm48 位于小麥 5DS 0.63~0.67 的染色體區段(圖 2-B)。

  

  

  2.3 重組體的篩選  

  利用 4129 個 F2 單株,通過接種 Bgt18 鑒定抗病性,結果有 3103 個抗病單株和 1026 個感病單株,符合單個顯性基因的3:1 分離(c2=0.04;c20.05,1=3.84)。這些感病單株移栽后完成整個生育期并收獲種子的有 671 個家系,對每個家系衍生的 15~20個植株進行表型鑒定后, 推測均為純合感病家系。 利用位于 Pm48 兩側的分子標記對這 671 個純合感病家系進行基因型檢測,其中共顯性標記 Xmp1112 和 Xcfd81 分別篩選到 12 個和 8 個重組家系;標記 Xmp928 和 Xmp510 對這 19 個重組體進行基因型的分析結果表明,Xmp510 檢測到 5 個重組體,Xmp928 沒有檢測到重組體,與目標基因共分離(表 2)。

  

  

  3 討論

  

  為進一步精細定位小麥抗白粉病基因 Pm48,本研究利用簡化測序和粗山羊草基因組序列信息開發了 6 個新標記。與實驗室之前發表的遺傳圖譜[19]相比,本研究在 Xgwm205 與基因之間新增了兩個 gSSR 標記(Xmp1089 和 Xmp1112),將 Pm48界定在 Xmp510 和 Xmp1112 之間的 4.6 cM 之間,為基因的進一步分離奠定了基礎。此外,還開發了一個與基因共分離的標記 Xmp928,該標記無論在小群體中還是在擴大的純合感病家系中均與抗病基因共分離,將作為抗病基因 Pm48 的重要選擇標記。Xmp928 是重復序列連接(repeat junction)類型的標記,這類標記在重復序列超過 80%的小麥基因組中非常豐富[27],將是小麥基因定位的重要標記類型,然而該類型標記無法與基因序列關聯,很難為基因分離提供幫助。

  

  簡化測序可以降低測序成本,根據性狀混池后測序更進一步降低成本。本研究利用 ddRAD 測序成功開發了 3 個 CAPS標記和 1 個 STS 標記,轉化了與基因關聯性強的 14 個 SNP 標記,其中 4 個(28.6%)為多態性標記,而其余標記沒有多態性。對于沒有轉化成功的 10 個 SNP 標記,推測是由于 ddRAD 測序后獲得的重復序列導致非特異性以及擴增引入的錯配。本研究還利用粗山羊草基因組序列開發了 71 個 gSSR 標記,但只有 2 個被定位,多態率為 2.8%,遠低于其他研究報道的 gSSR的多態率[28-30]。推測可能的原因,一是 D 基因組的多態性偏低[28-30],二是 Tabasco、寧糯麥 1 號兩親本的分子標記多態率低。對比上述兩種方法,利用混池的 ddRAD 測序效率較高。

  

  本研究利用 5DS 缺失系成功將抗病基因 Pm48 定位在小麥 5DS 0.63–0.67 的染色體區段中,這一區段的物理距離大約為55 Mb [31]。標記 Xcfd81 和 Xmp1112 相距 8.0 cM,假定兩標記位于邊界,該區域的重組率估算為 0.145 cM/Mb,低于 Erayman等[32]在該區域估算的重組率(0.341 cM/Mb),并非重組熱點區域。盡管如此,該區段較小的物理距離仍然將有助于抗病基因的分離。本實驗室將在以下兩方面進一步研究,一是解決標記多態性低的問題,準備利用不同的感病親本與 Tabasco 構建多個分離群體,構建 Pm48 的飽和遺傳圖譜;二是利用混池進行轉錄組測序,發掘 Pm48 候選基因。