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文獻解讀

集思慧遠客戶發表文章《全基因組鑒定鐵皮石斛的WRKY家族基因和尋找WRKY潛在的靶基因》

幸运飞艇官方开户FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:578

  鐵皮石斛  

  分類地位:單子葉植物綱,微子目,蘭科,石斛屬  

  

  摘要

  WRKY家族是最大的轉錄因子家族之一,在多種生物調節過程中發揮重要作用,包括生長、發育和脅迫響應。目前從鐵皮石斛中鑒定出63個 Do-WRKY 基因。這些基因分為多個家族,第一個家族有14個成員,第二個家族有28個成員,第三個家族有10個成員,無法歸類到以上家族的有11個成員。在WRKY基因上游1K的調節區域發現了ABA響應元件,S元素響應元件和低溫響應元件。評估63個Do-WRKY 基因在寒冷脅迫下的表達模式和這些基因在根和莖中被低溫調節的表達譜。為了進一步探索Do-WRKY基因在生物過程中的調節機制,需要研究WRKY的潛在靶基因。在這些基因中,大多數與脅迫相關基因的啟動子中包含多個W-box元件。此外,參與多糖合成和水解的基因在它們上游1K的調節區域含有W-box元件,暗示Do-WRKY的靶基因可能在多糖類的新陳代謝中發揮重要作用。這些結果為研究蘭科植物WRKY基因的功能和了解下游調控網絡提供了一個基礎理論。

  

  材料與方法

  1. 植物材料和脅迫處理  

  用1/2 MS固體培養基培育鐵皮石斛幼苗,萌發后10個月的幼苗作為實驗材料。對照組用1/2 MS液體在室溫條件下培養,實驗組在4℃條件下培養。分別在0h,2h,6h和12h去取根和莖,每個時間點取6棵植株作為一個樣品,用液氮冷凍后置于-70℃保存。每個實驗做3個生物重復。

  

  2、鐵皮石斛的WRKY基因鑒定和系統發育分析  

  從(http://202.203.187.112/herbalplant/)下載鐵皮石斛的CDS序列,用HMMER 3.0軟件將所有潛在的Do-WRKY TFs從鐵皮石斛蛋白序列數據庫中篩選出來。用NCBI檢測潛在的Do-WRKY TFs序列,剔除沒有保守結構域和鋅指結構域的序列,將剩下的序列用ClustalX version 2.1軟件比對,系統進化樹用無根相鄰嵌入法建立。

  

  3、保守序列分布和基因結構分析  

  用(version 4.11.2,http://meme.nbcr.net/meme)分析每條Do-WRKY的氨基酸序列的保守序列。在基因結構分析中,DoWRKY基因的相關基因組序列來自從藥用植物數據庫中下載的鐵皮石斛基因組序列(http://202.203.187.112/herbalplant/),用基因組和CDS序列構建基因結構簡圖,數據來自北京大學生物信息中心(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)

  

  4、Do-WRKY基因啟動子上的順式調節元件分析  

  Do-WRKY基因上游1kb的啟動子調節序列從數據庫下載獲得,從植物順式作用調節DNA元件數據庫PLACE(http://dbarchive.biosciencedbc.jp/en/place/download.html)下載的順式作用元件序列分析上游1kb啟動子上的順式作用元件是否存在。在基因物理圖譜中標記和顯示生物和非生物脅迫響應元件的位置。

  

  5、WRKT潛在靶基因的鑒定和注釋  

  將DoWRKY的DNA上游1kb的序列從基因組序列中篩選出來,用于檢測WRKY TF 結合位點元件(C/T)TGAC(C/T)是否存在。然后用實驗的方法在植物中驗證所有WRKY TF得結合位點。在上游啟動子區域存在3個或更多失水響應元件時,TFs和失水響應元件之間的識別效率越高,這一現象已用酵母單雜實驗證實。用NCBI,GO和KEGG的功能注釋:WRKY的靶基因至少擁有3個潛在的WRKY結合位點。

  

  6、qRT-PCR  

  用RNA提取試劑盒Column Plant RNAout2.0 (Tiandz, Inc., Beijing, China)提取RNA,然后反轉錄成cDNA,用ABI 7500 RT system對63個候選基因進行qRT-PCR,每個反應設置3個生物重復。

  

  7、表達數據的聚類分析  

  根和莖的表達模式熱圖通過 R 3.4.0.作圖,用Sigmaplot 12.3軟件的Dunnett測試方法統計分析

  

  結果

  1、  Do-WRKY轉錄因子的鑒定  

  從HMMER3.0平臺獲得83個已知的WRKY基因,通過NCBI BLAST進一步分析確認其中有81個具有WRKY結構域。這81個WRKY基因被編號為DoWRKY 1到DoWRKY 81。將沒有WRKY domain的DoWRKY 蛋白序列剔除,用3‘ RACE驗證剩余的63個Do-WRKY。發現高度保守的七肽區域WRKYGQK 存在于56個DoWRKY 蛋白序列中,有52個含有鋅指結構。

  

  

  2、  Do-WRKY蛋白質的分類  

  分析At-WRKY和Do-WRKY的系統發育關系,結果顯示63個Do-WRKY蛋白可能被分類為3個家族:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ。家族Ⅰ包含14個DoWRKY蛋白質,其中10個含有2個保守的WRKY區域(WRKYGQK)和2個鋅指motifs,另外4個只含有1個WRKY結構域。家族Ⅱ可以進一步分成5個亞家族,Ⅱa有4個成員,Ⅱb有3個成員,Ⅱc有9個成員,Ⅱd有6個成員,Ⅱe有6個成員,家族Ⅱ中的所有成員包含高度保守的WRKY結構域和鋅指結構。家族Ⅲ包含10個成員,每個成員含有單一的WRKY結構域和一個修飾后的鋅指結構。

  

  

  3、  Do-WRKY蛋白質的序列結構  

  一般來說,擁有相似motifs的成員,通常擁有相似的功能。為了更好的了解DoWRKY蛋白motif的相似性和多樣性,用在線軟件MEME分析DoWRKY蛋白的保守motif。(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi). 發現一共有20個motif, motif 1和motif 6都含有一個七肽motif結構:WRKYGQK,這是WRKY 家族的一個基本特征。

  

  

  4、  Do-WRKY基因的外顯子—內含子結構分析  

  通過分析內含子/外顯子的分布,深入了解Do-WRKY基因的結構特征,可以作為分析進化信息的一部分。在這63個Do-WRKY基因中,31個有3個外顯子和2個內含子,10個含有5個外顯子和4個內含子,9個含有4個外顯子和3個內含子,8個含有2個外顯子。擁有相似內含子/外顯子成分的DoWRKY基因通常會分類到同一家族。

  

  

  5、  Do-WRKY基因啟動子上的脅迫相關調節元件  

  順式作用元件,通常位于基因的5’端上游區域,是轉錄因子的結合位點,負責調節基因的轉錄。因此,在63個Do-WRKY基因上游1kb的調節區域內搜尋脅迫相關的調節元件。正如預料的那樣,大多數Do-WRKY基因的上游存在多個ABA響應元件。ABA在植物中是響應多種不利環境條件的重要信號分子,包括:寒冷、鹽害和干旱。Do-WRKY基因啟動子上的低溫響應元件數量僅次于ABA響應元件,能夠驅動基因的表達來響應低溫。硫響應調節元件能夠調節硫在植物體內的分布,也大量存在于啟動子上,暗示Do-WRKY基因在石斛屬植物中調節硫的分布中發揮重要作用。

  

  

  6、  Do-WRKY基因在寒冷脅迫下的表達  

  根據Do-WRKY基因上游1kb調節區域含有數量眾多的低溫脅迫響應元件的現象,為了獲得這些基因的表達模式,對鐵皮石斛的幼苗進行寒冷脅迫處理。用qPCR檢測根和莖中的DoWRKY基因在寒冷(4℃)的表達譜,用RNA-seq測定葉中此基因的表達譜。數據表明:根和莖中的Do-WRKY基因受低溫的調節。至少有兩個基因(DoWRKY1 和 DoWRKY14 )的表達出現上調。

  

  

  7、  Do-WRKY潛在靶基因的鑒定和注釋  

  測序后一共獲得了34417個潛在的鐵皮石斛基因,其中10757個基因在它們的啟動子上至少含有1個W-box元件,有7127個基因在啟動子上至少含有2個W-box元件,有3515個基因的啟動子上至少含有3個W-box元件。在這3515個基因中,Nr數據庫顯示有2504個基因與其他已知的基因和蛋白質有相互作用。根據序列同源性,用GO數據庫注釋了1305個基因,只有353個基因比對到了KEGG數據庫中的參考代謝通路上。GO數據庫將WRKY的靶基因在3個主要分類:生物過程,細胞成分和分子功能中分成了42個功能組。在生物途徑分析中,一共有253個基因分配到88個KEGG通路中,包括4個主要種類:新城代謝,環境信息過程,遺傳信息過程和細胞過程。大多數基因都歸類到新城代謝組中。

  

  

  

  8、Do-WRKY潛在靶基因的脅迫代謝路徑  

  Fig.8顯示的是植物中與脅迫相關的代謝通路。一個ACC合成酶基因(ACS)和2個ACC氧化酶基因(ACO)參與乙烯的生物合成途徑。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)基因和GDP-甘露糖 3,5-差向異構酶(GME),兩者都參與L-抗壞血酸的生物合成,在它們的啟動子上有3個W-box元件。海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因上游1 kb調節區域包含3個W-box元件。這些結果顯示:Do-WRKY基因可能通過調節脅迫相關基因的表達在鐵皮石斛中發揮重要作用。

  

  

  9、Do-WRKY靶基因可能是多糖代謝相關基因

  

  從以上分析可知:所有潛在的WRKY靶基因至少含有3個W-box元件。在糖類新陳代謝相關的基因中發現了這個現象。例如:糖基轉移酶類:葡萄糖基轉移酶,木糖基轉移酶,半乳糖基轉移酶,纖維素合成酶和甘露糖合成酶,都參與糖類的生物合成,在它們的上游1kb調節區域包含3~7個W-box元件。定位于高爾基體的核酸核糖轉移酶通過給高爾基體提供蔗糖對糖類的生物合成是必要的。Do-WRKY基因也可能調節這類糖轉移酶基因的轉錄,因為糖類轉移酶基因的啟動子上也有W-box元件。甘露糖苷酶和葡聚糖苷酶基因在上游1kb調節區域包含3~12個W-box元件,預示DoWRKY基因可能調節糖類的水解。研究還發現W-box元件也存在于淀粉酶的啟動子上。

  

  

  結論  

  從一種蘭科植物——鐵皮石斛中鑒定出63個WRKY基因。分析了DoWRKY蛋白的分類和保守結構域,以及Do-WRKY基因啟動子上的脅迫響應元件。63個DoWRKY基因中的17個受寒冷脅迫誘導,預示它們在鐵皮石斛響應寒冷脅迫中發揮重要作用。本研究探索了WRKY的靶基因,其靶基因的啟動子上含有W-box元件。研究發現在脅迫相關基因和碳水化合物代謝相關基因上有多個W-box元件,預示Do-WRKY基因可能參與調節非生物脅迫響應以及碳水化合物代謝。

  

  參考文獻  

  A Genome-Wide Identification of the WRKY Family Genes and a Survey of Potential WRKY Target Genes in Dendrobium officinale[J] Scientific Reports. 2017.IF=4.259