幸运飞艇官方开户

服務熱線:025-85381280
文獻解讀

集思慧遠客戶發表文章《亞洲梨在收獲和儲藏時表皮蠟質的化學成分、晶體形態和關鍵基因表達的研究》

幸运飞艇官方开户FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:548


  梨  

  學名: Pyrus spp  

  分類地位:被子植物亞門,雙子葉綱,薔薇目,薔薇科,梨屬  

  摘要

  

  對3種亞洲梨:庫爾勒,雪花和玉露香在收獲和貯藏7個月后表皮蠟質的化學成分,晶體結構和相關基因的表達水平進行分析、測定。其中,蠟質含量最高的是庫爾勒,最低的是雪花。表皮蠟質的主要成分是烷烴,脂肪醇,萜烯類化合物,脂肪酸和醛類化合物。儲藏后,所有品種的蠟質含量都出現減少,蠟質的晶體結構變得光滑。玉露香水果對黑斑病的抗性最強。基因表達分析顯示:在貯藏后涉及蠟質合成的4個結構基因(CER6, KCS9, KCS20 and FDH1)的表達水平較高,另外3個(CER60, DGAT1 and MAH1)的表達水平較低,2個轉錄基因(LTPG1 and LTP4)和1個轉錄激活因子(MYB96)的表達水平與蠟質含量一致。總的來說,了解水果在收獲和貯藏后表皮蠟質的差異能夠更好地理解它們對抗病性的貢獻和收獲后的儲藏性能。

  

  材料與方法

  

  1.  植物材料

  

  從用于商品的梨中挑選沒有疾病感染、物理損傷的3種不同品種的梨作為實驗材料。庫爾勒(Pyrus sinkiangensis Yü)收獲于2015.9.9,雪花(Pyrus bretschneideri Rehd.)收獲于2015.9.4,玉露香(‘Kuerle’ × ‘Xuehua’)收獲于2015.9.7.收獲后每個品種取100 個立即用來測定相關數據,另外每個品種再取100 個貯藏在3℃(相對濕度60~~80%)7個月,然后取出,在室溫下進行相關實驗。

  

  2.表皮蠟質的提取  

  將果實洗干凈后,于通風廚內把果實放在600mL氯仿內浸泡并攪拌1min,然后脫去其它物質,稱量并記錄蠟質的重量

  

  3.表皮蠟質含量的測定

  提取5個梨的表皮蠟質,計算5個梨的表面積,蠟質含量(g/m2)的計算方法為(W1-W0)/Sa, W1=容器和蠟質的總重量,W0=容器的重量,Sa=5個梨的表面積。

  

  4. 通過氣相色譜-質譜聯用儀分析化合物  

  將1mg的蠟質溶解在1.2mL的氯仿中制成樣品。用450-GC,連接320-MS和BR-5 ms毛細管色譜柱,(FS 30 m,0.25um ID,0.25 um df).用氦氣作為流動相,流動速率為1.2mL/min。參數設置如下:入口溫度280℃,MS離子束280℃,離子源250℃,四級桿溫度150℃,電子電壓70eV,質荷比的范圍:50~~650。  

  氣相色譜以下列溫度設置進行:首先,溫度在50℃維持2min,接下來以每分鐘上升40℃增加到200℃, 在200℃維持2min,最后,以3℃/min的速度增加到320℃,維持這個溫度30分鐘,每個單獨蠟質的樣品與標準品進行比較。

  

  5.電子顯微鏡觀察  

  從每種梨的中部用刀片取一塊(3 x 3 x 1 mm)的果皮切片,用2.5%的戊二醛固定1小時。然后用磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1mol/L, ph=7.4)沖洗3次,每次10分鐘。接著切片用2%的鋨酸(脂肪染料)處理1小時,用與上步相同的方式用PBS緩沖液沖洗。用不同濃度的乙醇30%,50%,70%,80%,90%進行脫水,依次處理10分鐘,然后用100%乙醇進行兩次脫水,每次10min。接著將樣品放在乙醇/叔丁醇=1:1的溶液中浸泡10分鐘。最后,產物放在叔丁醇中用Hitachi ES-2030 freezing drier冷凍干燥6小時。固定到樣品架上制成能夠觀察的標本,用電子顯微鏡進行觀察。

  

  6.通過qRT-PCR進行基因表達分析  

  總RNA的提取用Column Plant RNA Out kit (Fuji, China),cDNA的合成用RevertAid 1ST cDNA Synth Kit (Thermo, USA).用Primer Premier 5軟件設計特異性引物。qRT-PCR反應使用Light Cycler 480 (Roche, USA)定量儀。

  

  7.無損傷接種  

  7.1懸浮孢子的制備  

  黑斑病(Alternaria alternata)的致病孢子由南農植保學院提供。其孢子是從培養7天菌絲的PDA培養基上分離出來,懸浮在無菌蒸餾水中,懸浮液用3層滅菌擦鏡紙過濾,除去所有菌絲。為了讓孢子均勻分散,可將懸浮液放在振蕩器上震蕩15s。用血球計數板和無菌蒸餾水將孢子懸浮液的濃度調整為1*106個/mL。  

  7.2侵染  

  將梨用水洗干凈,風干,然后完全浸泡在孢子懸浮液中,使其表面形成一層菌膜。每個水果單獨放置在自封袋中在25℃條件下保溫7天。每個品種取60個隨機分成3組,每組20個,從第7天到第22天,每3天統計一下發病率,發病率以百分比的形式表示。

  

  8.統計分析

  表皮蠟質的化學成分用NIST 2013文庫進行分析。為了檢測聚類和建立關系,蠟質成分的數據集的主成分分析(PCA)和熱圖分析使用R 軟件進行。偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)用SIMCA-P software (V11.0, Umetrics, Umea, Sweden)操作。

  

  結果  

  1.  三個品種梨的表皮蠟質在收獲和貯藏時的化學成分的對比  

  1.1蠟質總量  

  三種梨在收獲后的蠟質總量通過氯仿萃取獲得。蠟質含量:庫爾勒>玉露香>雪花。GC-MS結果顯示:三種梨的蠟質成分在收獲時很相似,主要包括:烷烴,脂肪醇,脂類,脂肪酸,萜烯類化合物,醛類和其它未歸類的化合物。  

  庫爾勒品種的蠟質主要是:烷烴,脂肪醇  

  雪花品種的蠟質主要是:脂肪醇,萜烯類化合物

  玉露香品種的蠟質主要是: 脂肪醇,烷烴

  

  

  我們也分析了三種梨貯藏7個月后的蠟質含量,與收獲時相比,貯藏水果的蠟質含量有明顯的減少。為了進一步說明蠟質成分受貯藏的影響,我們對數據做了偏最小二乘判別分析(PLS-DA),結果顯示:每種水果的蠟質在收獲和貯藏后都有明顯差異。

  

  

  1.2 超長鏈(VLC)脂肪族化合物

  

  所有品種梨蠟質的主要成分是超長鏈脂肪族化合物,包括烷烴(C16~C43,17.36%~~54.60%),脂肪醇(C17–C41, 11.49%–38.67%),脂肪酸(C16–C24,3.51%–11.97%),醛類(C16–C18, 0–5.29%),酮類,烯烴和酯類(2.43%–8.62%)。

  

  

  1.3萜烯類化合物的比較分析

  

  除了脂肪族化合物之外,用GC-MS分析在表皮蠟質中發現了18種萜烯類化合物。貯藏7個月后,庫爾勒的萜烯類化合物明顯增加,雪花的明顯減少,玉露香的無明顯變化。

  

  2.在收獲和貯藏時的脂質結構  

  用掃描隧道電子顯微鏡(FESEM)鑒定三種梨在收獲和貯藏時的蠟質結構。(FESEM)觀測結果顯示:三種梨的蠟質晶體結構各不相同,庫爾勒品種的蠟質晶體最厚,雪花品種的最薄。玉露香品種的介于兩者之間。

  

  

  3.表皮蠟質對黑斑病菌侵染的影響  

  水果的表面覆蓋著蠟質能夠阻擋孢子萌發和菌絲生長。我們發現用黑斑病菌侵染三種梨在收獲和貯藏后的果實,表皮蠟質對病菌有抵抗功能。結果顯示三種梨在侵染后從第7天到第22天,黑斑病的發病率逐漸增加

  

  

  4.涉及蠟質合成,轉運和調節基因的表達模式

  為了探究三種梨的表皮蠟質不同的分子基礎,用qRT-PCR檢測了17個涉及蠟質合成,轉運和調節基因的表達水平。四個基因(KCS9,LTP3,CER2,MYB96)在貯藏后的表達水平比收獲后的高,另外7個基因(KCS20, CER6, FDH1, LACS2, GL8, LTPG1,LTP4)在貯藏后的表達水平比收獲后的低。

  

  

  結論  

  總的來說,烷烴和脂肪醇是三種梨表皮蠟質的主要成分。與收獲時相比,貯藏7個月后,表皮蠟質含量減少。三種梨表皮蠟質的晶體形態不同,可能是因為蠟質成分的比例不同。此外,研究顯示表皮蠟質對抵抗黑斑病具有貢獻。KCS20, CER6, KCS9, LTPG1 and MYB96的表達水平顯示這些基因在蠟質合成中發揮重要作用。

  

  文章點評

  1.果實表皮蠟質是有機物,用丙酮將其溶解萃取、分離、純化后研究,是一個很好、很精細的研究方法。  

  2.本文運用電子顯微鏡,以肉眼可見的微觀角度觀察表皮蠟質,有圖有真相,很有說服力。

  3.本文先研究生理生化的變化,然后研究引起變化的基因,用qRT-PCR結果做證據,由現象找原因是正向遺傳學的經典方法。

  

  參考文獻

  Chemical composition, crystal morphology and key gene expression of cuticular waxes of Asian pears at harvest and after storage[J] Postharvest Biology and Technology. 2017. IF=3.248