幸运飞艇官方开户

服務熱線:025-85381280
文獻解讀

集思慧遠客戶發表文章《核盤菌對油菜不同侵染階段的轉錄組分析》

幸运飞艇官方开户FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:657

  核盤菌:

  分類地位:子囊菌亞門、盤菌綱、柔膜菌目、核盤菌科、核盤菌屬。是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盤菌可以廣泛地侵染很多單子葉和雙子葉植物。另外,此菌危害十字花科、豆科、茄科、蕓香科等植物。一般情況下見到的多為該種的菌核,子囊盤從菌核上產生,油菜菌核的子囊盤比較容易獲得。

  

  

  摘要  

  油菜菌核病是一種造成許多重要作物巨大經濟損失的重要的植物病原菌。核盤菌與其宿主的相互作用比最初想象的更復雜,至今難以理解。在本研究中,對核盤菌侵染油菜葉片的RNA進行轉錄組分析。我們比對到了11,074,508 and 11,495,788對雙端reads。一共獲得了13313個基因。并按照 他們的功能類別進行分類。用核盤菌侵染6小時(hpi)和24小時后,不同上調程度的差異表達基因(DEGs)主要集中在DNA結合基因和ATP結合基因。然而離子結合和氧化還原酶基因在24小時后被激活。大部分在48小時后上調的DEGs屬于水解酶類。這些基因的表達水平與水解酶的功能相關。結果顯示:不同的基因在不同的階段被激活。在侵染過程中,我們對被激活的令人感興趣的基因的相對表達水平通過qRT-PCR進行評估。我們的研究結果為核盤菌的侵染機制提供了新的理論。

  

  材料與方法

  1.植物材料,真菌和生長條件  

  野生型油菜品種NRS-1用土壤種植在花盆中,至于溫室中,溫度為20±2℃,相對濕度為60~~90%,光照為12小時,黑暗為12小時,培養20周,核盤菌在PDA培養基上于25℃培養5天。

  

  2.樣品收集和制備  

  用于轉錄組測序RNA的樣品在4個不同時間點提取:沒有侵染的核盤菌,侵染油菜6小時后的核盤菌,侵染油菜24小時后的核盤菌,侵染油菜48小時后的核盤菌,用含有核盤菌菌絲體的PDA培養基接種葉片表面,然后將核盤菌從葉片和PDA培養基分離出來,每個處理包含10個樣品,將10 個樣品的核盤菌收集起來,混在一起,用于提取RNA。

  

  3.RNA提取和測序  

  用RNEasy Mini Kit (Qiagen, USA)提取總RNA。總RNA的含量、純度和降解量用Nanodrop 2000(Thermo Scientific, USA)分光光度計測定,在測序前用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。每個樣品中取出3 μg RNA用于 RNA 測序樣品的制備。測序文庫用NEBNext UltraTM RNA  Library Prep Kit for Illumina(NEB, USA)制備。文庫質量用Agilent Bioanalyzer 2100 system 測定。待測序列擴增建庫后, 在Illumina Hiseq platform上進行125 bp/150 bp 雙端測序。

  

  4.De novo 組裝  

  fastq格式的原始數據首先通過in-house perl scripts進行加工。在這個步驟中,clean data (clean reads)通過去除包含接頭,ploy-N,低質量的reads而得到。與此同時,評估clean data中的Q20, Q30和GC含量。所有后續分析都給予高質量的clean data。核盤菌的參考基因組和基因模型注釋文件從基因組網站直接下載。用Bowtie v2.2.3建立參考基因組數據庫,用TopHat v2.0.12比對雙端clean reads與參考基因組。

  

  5.Unigenes 的功能注釋  

  參照NR,Swiss-Prot,KEGG和COG數據庫用BLASTX方法,進行功能注釋。

  

  6.qRT-PCR分析  

  每個時間點的RNA,取出2 μg用Prime Script RT Reagent Kit (Takara, Japan)反轉錄成cDNA。用 CFX 9600 Real-Time PCR System (Bio-Rad, USA).進行qRT-PCR,每個基因做3個生物學重復。以基因Actin的表達水平為內參,計算各個基因的相對表達量。

  

  研究結果

  

  1.核盤菌在油菜葉片上造成的發病過程  

  核盤菌接種到油菜葉片上之后,用照片記錄了0,6,24和48小時后的發病癥狀。在0和6小時后,核盤菌沒有顯示生長,在24小時后,葉片顯示出感染癥狀,斑塊開始生長,在48小時后,斑塊的面積比24小時之后的大很多,并繼續生長,油菜葉片表面覆蓋有菌絲體。

  

  

  2.Illumina RNA-Seq測序和De Novo組裝和注釋

  將核盤菌在接種0,6,24和48 小時后的轉錄組進行測序,并將結果組裝。一共組裝出698830個contigs,平均長度67bp,最終的N50長度為49bp。核盤菌在侵染過程的差異表達基因通過接種6,24,48小時后與接種0小時后的基因表達譜比對獲得。分別發現了654個,449個和505個差異表達基因。

  

  

  3.差異表達基因的功能注釋  

  以侵染0小時為參照,對接種6,24和48小時后獲得的差異表達基因(DEGs)進行GO功能注釋。A:接種5小時后的DEGs 分類。B:接種24小時后的DEGs 分類。C:接種48小時后的DEGs分類。

  

  

  4.在不同階段激活的不同基因有不同的功能  

  以接種0小時的基因表達量為參照,接種6,24和48小時后的差異表達基因,根據它們的分子功能,對所有上調和下調的差異表達基因進行分類。A:接種6小時后上調的DEGs個數。B:接種6小時后下調的DEGs個數。C:接種24小時后上調的DEGs個數。D:接種24小時后下調的DEGs個數。E:接種48小時后上調的DEGs個數。F:接種48小時后下調的DEGs個數。

  

  

  5.有關基因表達水平的qRT-PCR驗證  

  挑選出來的差異表達基因的相對表達水平用qRT-PCR獲得,以接種0小時的基因相對表達量為標準,其它時間的數值是該時間的相對表達量與0小時的比值。

  

  

  結論  

  我們的結果顯示在侵染早期階段(0~~6hpi),核盤菌的目的是自身的生長。6hpi,差異表達基因主要參與菌絲體的生長,抑制由宿主植物產生的抗真菌蛋白的活性,降解植物細胞壁。在中期階段(6~~24hpi),核盤菌依靠細胞壁降解酶的功能開始侵染植物。然而,并不是所有有助于侵染的酶都在中期產生。角質層降解酶和果膠酯酶基因在后期階段被誘導(24~~48hpi),顯示不同的酶在不同的階段扮演不同的角色。我們的結果對核盤菌的侵染過程提供了新的見解,對負責油菜侵染過程提供了新的可研究基因。

  

  文章點評  

  1.本文主要從真菌的角度出發,運用轉錄組測序分析了真菌在侵染過程中自身基因發生的變化,并對有關的差異表達基因進行qRT-PCR驗證.  

  2.侵染植物并對植物造成病害的真菌菌絲體會深入植物葉片中,本文只收集葉片表面的菌絲體而沒有收集葉片內部的菌絲體,這會導致差異表達基因的數量統計有失偏頗。  

  3.本文用于轉錄組測序的RNA是每個時間的10個樣品混合在一起進行的,沒有設置生物學重復,單個時間的測序結果沒有對比,會導致置信度不高。

  

  參考文獻  

  Transcriptome Analysis of Sclerotinia sclerotiorum at Different Infection Stages on Brassica napus . Curr Microbiol .2017.IF=1.322