幸运飞艇官方开户

服務熱線:025-85381280
文獻解讀

集思慧遠客戶發表《RNA序列分析揭示穿心蓮種子萌發過程中激素代謝和信號轉導的關鍵作用》

FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:499




  穿心蓮是東南亞廣泛應用的一種傳統藥用植物,其提取物通常用于治療肝炎和糖尿病以及炎癥,認知和精神疾病。一般來說,這種植物是由種子繁殖的,但是種子的萌發是高度可變的。不可靠的發芽使種植變得更困難、效率更低、生產力更低。了解控制發芽的因素將使種植者能夠設計提高種植效率的方法。

  本研究采用高通量測序法(RNA-seq)分析了穿心蓮種子萌發過程中三個時間點即播種后0、28和48h的轉錄組變化。轉錄組比較分析表明,大多數變化發生在萌發的早期階段。GO和KEGG通路分析表明,差異表達基因主要涉及丁酸鹽、半乳糖、甘油磷脂和碳代謝,以及植物激素信號轉導。在萌發過程中,赤霉素、脫落酸、乙烯代謝和信號轉導相關基因的表達水平發生顯著變化。qRT-PCR分析證實了相關基因的轉錄表達水平,這意味著激素代謝和信號轉導在穿心蓮種子萌發中的重要作用。本研究首次全面概述了與穿心蓮種子萌發相關的基因表達,為進一步研究種子萌發的分子調控機制提供了轉錄組數據。


  材料與方法

  材料

  廣西省貴港市地區的成熟植物中獲得了健康的穿心蓮。選擇成熟的(黃褐色)種子,使其大小一致。種子初始含水量為11.6%,千粒重為1.1080 g。

  種子發芽測定:在37°C條件下,用恒溫培養箱將種子浸泡于蒸餾水中,打破休眠。用75%(v/v)乙醇洗滌45s左右,再用0.1%(w/v) HgCl2浸泡5min。然后,用蒸餾水洗三次后,將種子撒在培養皿中的濾紙上。每盤播種100粒種子,每組4粒。所有樣品均在實驗室的培養箱中以光/暗循環(12h/12h)條件下(27.5±1°C)進行培養。當胚根長到1mm時,就算萌發出完整的種子。取3組種子進行RNA提取:播種后0h,28h,48h,每組3個重復。


  方法

  測序平臺:Illumina HiSeq 2500,PE125;組裝:Trinity;contig組裝:TGICL;功能注釋:NR,Swiss-Prot,COG,Pfam,BLASTX;GO注釋;KEGG富集;qRT?PCR。


  結果分析

  1.種子萌發性狀的評估

  Fig.1 穿心蓮種子萌發的評估


  表型分析表明,胚根在0、28、48 HAS具有萌發過程。在此基礎上,確定28 HAS為種子萌發的起始期,48 HAS為種子萌發的高峰期。


  2.文庫構建、RNA-seq和轉錄本的功能注釋

  Fig.2 RNA-seq產生的Unigenes的特征分析


  a. Unigenes長度分布;b. Unigenes的BLASTX配對的同源物種分布


  3.穿心蓮種子萌發過程中轉錄組的變化

  根據RNA-seq數據和單基因功能注釋,進一步分析了種子萌發過程中轉錄組的變化。


  Fig.3穿心蓮不同萌發階段轉錄本動態變化的分析


  a.比較28 HAS與0 HAS,48 HAS與28 HAS,48 HAS與0 HAS的DEG數;b.維恩圖顯示了不同萌發階段上調和下調基因的重疊;c.種子萌發過程中所有DEG的GO分析

  為了深入了解DEGS在種子萌發過程中的作用,對3個發芽期各DEGS的KEGG途徑進行了分析。


  Fig.4穿心蓮種子萌發過程中所有DEGs的KEGG分析


  a.KEGG在種子萌發過程中的富集;b.植物激素信號轉導途徑的熱圖。框的顏色表示不同的表達模式,紅色(I)代表28 HAS出現的最高表達水平,48 HAS出現的最低表達水平;黃色(II)為0HAS出現的最高表達水平;綠色(III)為48HAS最高表達水平,28HAS最低表達水平;紫色(IV)表示48HAS最高表達水平,0HAS最低表達水平;黑色(V)表示28 HAS出現的最高表達水平,0 HAS出現的最低表達水平。


  結果預測,大部分DEGS與丁酸(butanoate)、半乳糖(galactose)、甘油磷脂(glycerophospholipid)和碳代謝(carbon metabolisms)有關。大多數參與植物激素信號轉導的DEGS在28 Has和48 Has高表達,而在0 Has時未表達。這意味著植物激素信號轉導是一個級聯過程。植物激素信號轉導途徑中的基因在萌發過程中受到越來越多的代謝活性的刺激。


  4. GA、ABA和乙烯代謝相關基因的轉錄譜及信號轉導

  此前的研究表明,多種植物激素,包括GA、ABA、生長素和乙烯在控制種子萌發中起著至關重要的作用。


  Fig.5植物激素相關基因在種子萌發過程中的表達模式


  GA生物合成基因GA20ox1和GA3OX2的表達在28HAS和48HAS時均高于0HAS,而48HAS與28HAS相比表達下調。這表明GA的生物合成在種子萌發初期開始和發展迅速,然后在高峰階段減緩。相反,GA分解代謝基因GA2OX1和GA2OX8在種子萌發的三個階段逐漸下調。

  RNA-seq分析顯示ABA受體基因PYL2和PYL6被激活,而關鍵轉錄因子ABI5在種子萌發過程中被抑制,說明ABA信號轉導參與。有趣的是,ABA的關鍵生物合成基因NCED5的表達在28HAS上調,48HAS下調,而0HAS下調。一個ABA分解代謝基因CYP707A4在28 Has和48 Has表達上調。表明ABA分解代謝在種子萌發過程中的動態參與。


  結果顯示,與0HAS相比,與乙烯信號轉導相關的3個基因EIN2、EIN3和ERF118在28HAS和48HAS被激活,這表明乙烯在種子萌發中起著關鍵作用。與28HAS相比,EIN3和ERF118在48HAS表達減少,這表明種子萌發可能需要快速的乙烯信號轉導。


  5. 用qRT-PCR分析驗證RNA-Seq數據

  為驗證RNA-seq數據,采用qRT-PCR分析檢測了13個顯著DEGS的表達水平。

  Fig.6 RNA-seq數據的驗證


  選擇的基因大多是參與植物激素的代謝或信號轉導相關的,還選擇了一些與種子萌發沒有明顯關系但在種子萌發過程中表現出顯著差異的基因。如圖所示,這些基因的表達模式與它們的轉錄表達模式基本一致。


  總結

  1.結果表明,GA、ABA和乙烯代謝和信號轉導等在控制種子萌發過程中起著重要作用,可能決定穿心蓮種子是否發芽以及何時發芽。

  2.GA和(或)乙烯處理與溫水浸種軟化相結合,可能是促進穿心蓮種子萌發的有效途徑。

  原文鏈接:http://doi.org/10.1007/s00344-018-9839-2