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文獻解讀

集思慧遠客戶發表《24-表油菜素內酯誘導香蕉果實耐冷性的蛋白質組學分析》

幸运飞艇官方开户FABURIQI:2019-03-17 LIULANCISHU:517



  香蕉由于其更年期特性,是世界范圍內重要的水果之一,保質期短。低溫貯藏被認為是延長收獲作物貯藏壽命的有效策略。然而,當貯藏溫度低于13℃時,香蕉果實易受冷害(CI)的影響。香蕉果實的CI癥狀包括延緩黃色發育、皮膚斑點和和果實軟化失敗,這導致嚴重的質量惡化和巨大的經濟損失。


  先前研究發現一些緩解香蕉果實CI的策略,其中包括乙烯、一氧化氮、硫化氫、蘋果酸和熱處理證明是有效的。植物激素被認為參與調節植物的反應、防御和適應環境。最近的研究表明,一些植物激素,包括乙烯、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、油菜甾醇(BRs)和赤霉素(GAs)與果實冷應激響應有關。在這些植物激素中,BRs是一種綜合性的功能性類固醇激素,參與了許多生理過程,特別是在提高植物對非生物和生物脅迫的耐受性方面。在收獲作物中,施用外源BRs可顯著提高芒果、青椒、油菜、番茄和葡萄藤對低溫脅迫的耐受性。然而,BRs對香蕉果實CI的影響及其可能的作用機制還未見報道。


  材料與方法

  植物材料與處理

  植物材料:開花后約110天綠色成熟香蕉;

  處理組:40μM EBR水溶液中浸泡;

  對照組:水中浸泡;

  低溫處理:置于8℃和85~90%RH條件下貯藏12天;

  生理學參數測定:CI指數、葉綠素熒光參數、相對電解質滲漏量、丙二醛(MDA)含量、總可溶性固形物(TSS)、總可溶性固形物(TSS)和可滴定酸度(TA)比值;

  蛋白質組學分析:果皮組織(中部),設置6個重復。

  注:設置3個重復對CI指數進行測定,每重復30個果實,并設置6個重復測定其它生理參數。


  蛋白質組學分析

  檢測平臺:2-D凝膠電泳、MALDI-TOF/TOF MS、LC-ESI-MS/MS;

  分析軟件:MagicScan V6.0和PDQuestTM Basic 2-D凝膠分析軟件8.0.1(Bio-Rad)用于電泳;Mascot 2.3.02軟件用于搜庫;Blast2Go軟件(4.0版)用于GO富集;Cytoscapage(版本3.0.2)軟件用于蛋白質互作分析;SIMCA(版本15.0)用于PCA分析、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和偏最小二乘(PLS)回歸分析。


  主要結果

  香蕉果實經EBR預處理后冷藏生理特性的研究

  圖1A描述了香蕉果實冷藏結束后(12d)的CI癥狀,果皮褐變、變色、皺紋嚴重。EBR處理能有效降低低溫貯藏期間果實CI的嚴重程度(圖1A和B)。隨著CI的增加,對照果實中的Fv/Fm隨著CI的發展而明顯降低(圖1C)。與對照相比,EBR預處理延緩了Fv/Fm的下降(圖1C)。果皮的相對電解質滲漏量和MDA含量隨貯藏時間的延長而增加(圖1D和E)。在整個貯藏過程中,EBR處理果實的相對電解質滲漏量和MDA含量均顯著低于對照果實(圖1D和E)。此外,比對照果實相比,EBR處理還導致較高的TSS含量和TSS/TA(圖1F和G)。


  Fig.1. Effect of EBR pretreatment on banana fruit after 12-day.

  圖1.EBR預處理對香蕉果實12天后的影響

  注:在低溫儲藏下的香蕉果實(A)、CI指數(B)、Fv/Fm(C)、相對電解質滲漏(D)、MDA含量(E)、可溶性總固形物(F)和可溶性固形物/可滴定酸比(G)。數據為均值±標準差(n=3)。不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)。


  香蕉皮冷藏過程蛋白質組學分析

  采用雙向電泳(2-DE)分析方法,研究了香蕉果實低溫貯藏過程中蛋白質組學的變化。如圖2所示,PDQuest2-D分析軟件檢測了700多個可重復的蛋白質斑點。經全密度歸一化后,有55個斑點差異累積(P<0.05),豐度相差3倍以上,并通過MALDI-TOF/TOF MS和LC-ESI-MS/MS成功鑒定。

  Fig.2. two-dimensional electrophoresis maps

  圖2 二維電泳圖譜

  注:在低溫貯藏的不同階段,具有和不具有EBR處理的香蕉果皮的代表性的二維電泳圖譜。標記的蛋白質點是被鑒定出來的顯著差異的蛋白質點。


  已鑒定蛋白質的功能分類和積累模式

  根據BLAST2GO分析,將55個差異積累的蛋白質分為7個功能類(補充圖S2、表1)。主要功能類為能量、新陳代謝、應激反應和防御以及蛋白質代謝過程。

  Table 1. Identity of proteins differentially accumulated from banana peel with and without EBR treatment at different stages of low temperature storage.


  表1.香蕉皮不同低溫貯藏期EBR處理前后差異積累蛋白質的鑒定(部分)

  注:黑色是對照香蕉果實,而灰色則是EBR處理的果實。PC:肽段數目。進行非參數方差分析(Kruskal-Wallis檢驗),并對鑒定的蛋白質進行多重比較平均排序。不同字母表示具有顯著性差異(p<0.05)。


  蛋白質差異積累的PLS-DA和PLS分析

  為比較EBR處理與不加EBR處理香蕉果實蛋白質的差異,采用PLS-DA分析方法。置換校驗表明,原模型是有效的(補充圖S4)。將PLS-DA模型的前兩個潛在組分獲得的分數和相關載荷組合在雙曲線中。PLS-DA的前兩個組分占樣本間方差的59.8%(圖3A)。如圖3A所示,在第8天,沿著成分1從不同處理中分離出果實。在第12天,用不同處理的果實,沿著組分2分離出果實。相反,在第4天不同處理的果實在同一1/4內均有分布。與PCA分析相一致,這些結果也表明,在第4天的樣本不能被區分,而來自不同處理的樣本在第8天和第12天很容易被識別。此外,VIP值超過1.0的變量通常被認為在PLS-DA判別過程中起著重要作用。結果表明,VIP超過1的22種蛋白質(B10、B51、B29、B49、B53等)可以解釋EBR處理后低溫貯藏香蕉果實的分離(圖3B)。


  Fig. 3. PLS-DA analysis of differentially accumulated proteins.

  圖3.蛋白質差異積累的蛋白質分析

  注:(A)PLS-DA得分圖;(B)按VIP評分排列的蛋白質,以解釋PLS-DA分析中的差異。


  同時,采用偏最小二乘法(PLS)回歸分析差異積累蛋白與生理特性的關系(圖4)。置換校驗也證實了原模型的有效性(補充圖5)。結果表明,B53與CI呈極顯著正相關(圖4A),其次為B54和B10。B5與CI呈極顯著負相關,其次為B39、B40、B33、B27和B37。所有這些蛋白質的VIP分數顯著高于1,這表明這些差異積累的蛋白質主要貢獻于CI(圖4B)。同樣,我們也發現了B10,B39、B33、B37、B40和B53與Fv/Fm值相關(圖4C和D)。B10、B39、B21、B37、B53、B51與MDA含量顯著相關(圖4E和F)。其中B39、B10、B33、B37、B40、B53和B5與相對電解質滲漏有關(用高回歸系數和VIP得分)(圖4G和H)。


  Fig.4. PLS analysis on differentially accumulated proteins and physiological factors.

  圖4.差異積累的蛋白質與生理因素的相關性

  注:CI(A)、FV/FM(C)、MDA(E)和相對電解質滲漏(REL)的回歸系數(G);(B、D、F和H)根據VIP評分,鑒定出的蛋白質依次為CI、FV/FM、MDA和相對電解質滲漏。


  蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)關鍵差異累積蛋白的網絡分析

  如上所述,CI涉及一個復雜的生物學過程,與眾多蛋白質的相互作用有關。使用STRING數據庫進行PPI分析可以幫助加強我們的蛋白質組學分析,獲得更多的差異累積蛋白質的功能信息。因此,我們進行了PPI分析,進一步闡明EBR處理后差異積累蛋白的作用。在本研究中,PPI結果顯示了四個重要的功能類別,共有23個節點(補充表S1),主要涉及能量代謝、蛋白質代謝、應激反應/防御和調節(圖5)。EBR預處理影響蛋白質修飾,進而調節能量代謝和應激反應。此外,生物調控還可能促進香蕉果實在冷藏過程中的防御能力。總體上,PPI分析表明,參與不同生理過程的差異積累蛋白可能相互作用并協同作用以提高香蕉果實的耐冷性。

  Fig. 5. PPI analysis of differentially accumulated proteins.

  圖5.差異累積蛋白的PPI分析


  總結

  外源EBR處理顯著降低了香蕉果實冷藏過程中CI的發育和嚴重程度。低溫下EBR預處理后香蕉果實蛋白質的差異積累主要與脅迫、能量代謝和分解過程有關。結果表明EBR處理能促進生長素信號傳遞、脅迫防御能力和抗氧化系統的增強。同時,EBR處理可抑制蛋白質降解,維持蛋白質生物合成,有利于香蕉果實在低溫儲藏過程中蛋白質功能的正常行使。蛋氨酸do novo合成相關蛋白被上調,可能有助于多胺的生物合成和增強耐冷性。EBR處理也保持了較高的能量狀態,為蛋白質的生物合成和復性提供了足夠的ATP。


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